乙型肝炎病毒(HBV)實(shí)時(shí)熒光定量PCR.doc

乙型肝炎病毒（HBV）實(shí)時(shí)熒光定量PCR目的要求掌握 血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR的測(cè)定原理； HBV-DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析了解 核酸測(cè)定引物設(shè)計(jì)原理；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的工作原理及操作。教學(xué)時(shí)數(shù)講授2學(xué)時(shí)，實(shí)驗(yàn)6學(xué)時(shí)。講授內(nèi)容血清中病毒DNA的提取方法和原理；實(shí)時(shí)熒光定量PCR的測(cè)定原理；核酸測(cè)定引物設(shè)計(jì)原理；HBV-DNA測(cè)定引物設(shè)計(jì)思路；HBV-DNA熒光定量PCR試劑組成、相應(yīng)作用及反應(yīng)混合液配制；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的工作原理及操作實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分組提取血清中HBV-DNA；配制反應(yīng)液并上機(jī)操作，實(shí)時(shí)觀察，結(jié)果分析；實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論；實(shí)驗(yàn)總結(jié)自學(xué)內(nèi)容“感染性疾病的分子診斷”實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（自編） 實(shí)驗(yàn) 乙型肝炎病毒（HBV）實(shí)時(shí)熒光定量PCR【原理】Real time PCR 是普通PCR 的一項(xiàng)改進(jìn)，使用了針對(duì)擴(kuò)增DNA 的熒光物質(zhì)，使得DNA的數(shù)量與檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，大致得到DNA 的擴(kuò)增曲線，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。即對(duì)DNA靶分子的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量的核酸檢測(cè)。該方法精確、靈敏、特異性強(qiáng)、污染途徑小、自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)單。是國(guó)際公認(rèn)的核酸分子定量的標(biāo)準(zhǔn)方法。它已逐漸代替了Northern blotting 以及semi RT-PCR技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)從HBV攜帶者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因組DNA，采用核酸擴(kuò)增結(jié)合TaqMan熒光探針技術(shù), 利用一對(duì)乙肝病毒特異性引物和一特異性結(jié)合于擴(kuò)增區(qū)另一位點(diǎn)的TaqMan探針, 實(shí)現(xiàn)對(duì)乙肝病毒模板的擴(kuò)增和檢測(cè)。使用商品化試劑盒：HBV實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。針對(duì)表面抗原S基因，設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一個(gè)探針。TaqMan熒光探針技術(shù)中，兩個(gè)熒光染料標(biāo)記在探針上，一個(gè)叫報(bào)告基團(tuán)（R），一個(gè)叫淬滅基團(tuán)（Q）。當(dāng)兩個(gè)熒光基團(tuán)都連在探針上時(shí)，報(bào)告基團(tuán)的熒光被淬滅基團(tuán)抑制。在延伸中，DNA聚合酶利用53外切酶活性把報(bào)告基團(tuán)從探針上切下來。一旦和淬滅基團(tuán)分開，報(bào)告基團(tuán)釋放出熒光。通過監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的積累來反映乙肝病毒DNA的擴(kuò)增.產(chǎn)物的積累，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征使用外部標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)初始模板定量（圖4）。 圖4：TaqMan熒光探針技術(shù)原理 R:熒光報(bào)告基團(tuán) Q：熒光淬滅基團(tuán)【試劑與器材】1HBV-DNA檢測(cè)試劑盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR預(yù)混合液（含有Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、熒光標(biāo)記的探針）、Taq酶、UNG，強(qiáng)陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、臨界陽性血清，四種不同濃度的陽性參控品、雙蒸去離子水。2熒光定量PCR儀3PCR反應(yīng)管4移液器及移液器吸頭5高速離心機(jī)6漩渦混合器7超凈工作臺(tái)8調(diào)溫電熱板【操作步驟】1. 試劑和主反應(yīng)混合物的準(zhǔn)備：從試劑盒中取出HBV PCR反應(yīng)液、Taq酶及UNG。室溫融化后，2000rpm離心10sec，設(shè)需要的管數(shù)為n（n=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管強(qiáng)陽性對(duì)照+1管室內(nèi)質(zhì)控+1管試劑空白+4管陽性參控品），40ul測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：試劑PCR反應(yīng)液Taq酶UNG用量37.6ul0.4ul0.06ul計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向設(shè)定的n個(gè)PCR反映管中分別加入38ul，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。2. 樣本的制備和上樣（1）標(biāo)本處理取n個(gè)0.5ml滅菌離心管，做好標(biāo)記。首先加入100ulDNA提取液1，再分別加入待測(cè)血清或血漿樣本（切勿吸入血細(xì)胞）以及各種對(duì)照品各100ul，振蕩混勻，13000rpm離心10min：吸棄上清（離心時(shí)注意固定離心管方向，盡可能吸棄上清且不碰沉淀）；再加入25ulDNA提取液2，振蕩10sec（沉淀無需打散、混勻），100干浴，13000rpm離心10min，保留上清備用。如果樣本裂解產(chǎn)物當(dāng)天不使用，則要保存在-20。（2）上樣若樣本及對(duì)照品裂解產(chǎn)物保存在-20，使用前置室溫解凍，以13000rpm離心5min。在所設(shè)定的n個(gè)反應(yīng)管中分別加入步驟1中處理過的樣本、陰性對(duì)照、強(qiáng)陽性對(duì)照和室內(nèi)質(zhì)控血清、滅菌去離子水以及陽性參控品各2ul，蓋緊PCR反應(yīng)管管蓋，并記錄樣本信息。3. PCR上機(jī)擴(kuò)增檢查反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器；檢查并消除反應(yīng)管底氣泡。按設(shè)置裝載反應(yīng)管，選擇或設(shè)置擴(kuò)增和檢測(cè)條件：選擇預(yù)設(shè)的程序文件或設(shè)置為：370C：3min；940C：1min；950C：5sec，600C：30sec，40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)收集設(shè)在600C。設(shè)置模板：設(shè)置孔位及熒光（詳見相應(yīng)儀器的操作手冊(cè)）。保存數(shù)據(jù)文件并運(yùn)行。4. 結(jié)果分析（1）設(shè)置分析條件：設(shè)定基線：不同的PCR儀操作略有不同，按儀器說明書操作。PE7700:分析前把標(biāo)準(zhǔn)熒光定為TAMRA。如果沒有Ct16的強(qiáng)陽性樣品，應(yīng)選315個(gè)循環(huán)的平均熒光信號(hào)作為基線再分析Ct；如果有Ct16的樣品，則將此樣品定為強(qiáng)陽性，并將此樣品從數(shù)據(jù)庫(kù)中剔除，然后以315個(gè)循環(huán)的平均熒光信號(hào)作為基線再分析Ct。ICycler：基線一般取自設(shè)值（210）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，點(diǎn)擊PCR baseline subtract選項(xiàng)扣除基線值。若某些曲線出現(xiàn)無規(guī)則的起伏跳動(dòng)，應(yīng)視為非正?，F(xiàn)象，此時(shí)將其從結(jié)果中剔除（點(diǎn)擊select wells,消除此孔彩色，然后選擇display wells）。注意調(diào)整坐標(biāo)，使所有曲線都在坐標(biāo)內(nèi)，見圖5。LightCycler：用熒光顯示模式F1/F2讀取結(jié)果?；€設(shè)定原則以剛好超過正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)值時(shí)為準(zhǔn)（一般定在0.0010.01范圍內(nèi)，也可以根據(jù)儀器本身的實(shí)際情況加以調(diào)整）。域值設(shè)定：以剛好高于陰性對(duì)照品的擴(kuò)增曲線最高點(diǎn)，且陰性對(duì)照品Ct=40或Ct=0為原則，調(diào)整起始域值。（2）實(shí)驗(yàn)有效性判斷：檢查質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)同時(shí)符合下列條件，見圖5：（否則試驗(yàn)視為無效）陰性對(duì)照、試劑空白CT值都為0強(qiáng)陽性對(duì)照和室內(nèi)質(zhì)控CT值不為0，且強(qiáng)陽性小于室內(nèi)質(zhì)控，拷貝數(shù)在105107間。標(biāo)準(zhǔn)品CT值小于38，且標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率在-3.5 -4.0間，截距在40 50間，相關(guān)系數(shù)小于-0.98。A.B.圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析E8, F8, G8, H8為標(biāo)準(zhǔn)品，D8為待測(cè)樣本，C8為陰性對(duì)照；A：基線、域值設(shè)置， B.：標(biāo)準(zhǔn)曲線5. 檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告：檢測(cè)樣本中103copies/ml HBV DNA 5107copies/ml，可直接報(bào)告相應(yīng)的拷貝數(shù)；檢測(cè)樣本中HBV DNA 103copies/ml時(shí)，均報(bào)告為 103copies/ml。檢測(cè)樣本中HBV DNA 為 0copies/ml時(shí) ，報(bào)告為 5107copies/ml時(shí)，均報(bào)告為 5107copies/ml【注意事項(xiàng)】1操作中應(yīng)使用不含熒光物質(zhì)的一次性手套（經(jīng)常更換）、一次性吸頭（最好帶濾芯），并不能用手直接接觸擴(kuò)增管。2操作臺(tái)、離心機(jī)、移液器、PCR擴(kuò)增儀等應(yīng)定期用10%次氯酸鈉或70%酒精擦拭去污染。3熒光探針應(yīng)避光保存，配制好反應(yīng)液體系，應(yīng)盡快上機(jī)擴(kuò)增。4配置反應(yīng)體系時(shí)，應(yīng)注意移液器的使用方法，所有液體的混勻要使用振蕩器進(jìn)行，不能用移液器吹打。5所有試劑開蓋前，應(yīng)短暫離心。6配制反應(yīng)體系過程中若需標(biāo)記，請(qǐng)?jiān)谠嚬芑螂x心管架上標(biāo)記，不要直接標(biāo)記在擴(kuò)增管上?！舅伎碱}】通常PCR有典型的變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)，為何本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增溫度循環(huán)只有兩溫度點(diǎn)：950C：5sec，600C：30sec，40個(gè)循環(huán) ？1.一般典型陽性的擴(kuò)增曲線有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（熒光信號(hào)呈指數(shù)上升，曲線平直且有一定斜率），以及平臺(tái)期（熒光信號(hào)無明