病毒的形態(tài)學(xué)診斷.doc

實(shí)驗(yàn)十 病毒的形態(tài)學(xué)診斷、培養(yǎng)方法和血清學(xué)試驗(yàn)?zāi)?的（一）觀(guān)察病毒包涵體，并掌握其診斷意義。（二）掌握病毒的形態(tài)并了解病毒包膜的獲得。（三）了解病毒培養(yǎng)的三種方法。（四）掌握病毒學(xué)中主要血清學(xué)反應(yīng)的原理（五）熟悉病毒血凝抑制試驗(yàn)的測(cè)定過(guò)程內(nèi) 容（一）病毒的形態(tài)學(xué)診斷1. 病毒的電鏡照片（示教）2. 狂犬病毒包涵體（示教）3. 麻疹病毒包涵體（示教）（二）病毒的培養(yǎng)法（錄像） 1. 病毒的動(dòng)物接種法 2. 病毒雞胚培養(yǎng)法 3. 病毒的組織培養(yǎng)法 （三）血凝抑制試驗(yàn)（操作）一、 病毒的形態(tài)學(xué)診斷病毒形態(tài)學(xué)研究方法可分為兩種：一種是應(yīng)用電子顯微鏡技術(shù)，觀(guān)察其大小，形態(tài)及排列特征，以幫助診斷；另一種是應(yīng)用光學(xué)顯微鏡通過(guò)涂片染色或切片染色，觀(guān)察包涵體。病毒感染細(xì)胞所產(chǎn)生的包涵體，其特征基本是固定的，故對(duì)病毒性疾病的診斷具有一定價(jià)值?！痉椒ā浚ㄒ唬┎《镜碾婄R照片（示教）觀(guān)察腺病毒、皰疹病毒的電鏡照片，注意其形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小、排列、及其包膜的形成。（二）狂犬病病毒內(nèi)基（Negri）包涵體（示教）用高倍鏡或油鏡觀(guān)察經(jīng)HE（蘇木紫-伊紅染色）染色的死于狂犬病的犬腦組織切片，注意包涵體在細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)、位置及染色性。（三）麻疹病毒包涵體（示教）用高倍鏡或油鏡觀(guān)察經(jīng)麻疹病毒培養(yǎng)后，HE染色的人胚或羊膜細(xì)胞標(biāo)本片，注意包涵體在細(xì)胞內(nèi)的位置、形態(tài)、染色性以及細(xì)胞融合情況。二、 病毒動(dòng)物接種法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在病毒學(xué)研究中有四方面用途：分離鑒定病毒，如乙腦病毒；連續(xù)傳代通過(guò)，以減弱有毒株對(duì)人的致病力，如狂犬病病毒；制備抗血清；病毒致病機(jī)理的研究。常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小白鼠、地鼠、豚鼠、家兔、綿羊、雞、猴等。在病毒學(xué)研究中，動(dòng)物接種時(shí)為避免動(dòng)物本身可能帶有病毒，多采用實(shí)驗(yàn)室自己繁殖的動(dòng)物。首先根據(jù)研究目的選擇動(dòng)物種類(lèi)，對(duì)病毒致病機(jī)制的研究，則選擇愈接近人類(lèi)的高等動(dòng)物（例如靈長(zhǎng)類(lèi)）研究結(jié)果愈有價(jià)值；其次要注意動(dòng)物的年齡、性別和接種的途徑等各種因素，一般年幼的動(dòng)物比成年動(dòng)物對(duì)病毒的敏感性高。至于接種的途徑應(yīng)根據(jù)病毒的嗜性決定，例如腦炎病毒以腦內(nèi)注射最敏感。（一）小白鼠尾靜脈接種（錄像）【材料】1. 動(dòng)物：小白鼠2. 病毒懸液3. 碘酒、酒精、二甲苯、無(wú)菌0.25ml注射器、4號(hào)針頭及小鋁匣【方法】1. 將小白鼠固定在小鋁匣內(nèi)，露出尾部，用碘酒消毒尾部，然后用酒精棉球連續(xù)擦尾部皮膚（必要時(shí)用二甲苯擦）使血管擴(kuò)張。2. 尾背和左右兩側(cè)三根血管皆為靜脈，可選一根擴(kuò)張較好的靜脈作接種用。左手拇指捏住尾部的遠(yuǎn)端，向下彎45，右手持注射器，于彎處進(jìn)針靜脈，推液0.1毫升。注意：推注時(shí)遇阻力且皮下隆起發(fā)白時(shí)，表示針頭不在血管內(nèi)應(yīng)拔出重新進(jìn)針；如針頭在血管內(nèi)，推注時(shí)不感阻力，且可看到血管中血液由于注入液體而后退。接種后逐日觀(guān)察動(dòng)物發(fā)病情況。（二）小白鼠鼻內(nèi)接種（錄像）【材料】小白鼠、流感病毒鼠肺適應(yīng)株病毒懸液、無(wú)菌小試管、無(wú)菌毛細(xì)管、麻醉用乙醚、棉球及小玻瓶?！痉椒ā?. 首先將沾有乙醚的棉球放入一清潔小玻瓶?jī)?nèi)。左手握小瓶，右手抓住小白鼠，將其頭部塞入瓶口，進(jìn)行全身麻醉。注意麻醉深度，不宜太淺或太深，太深時(shí)易遭致麻醉死亡或非特異性吸入性肺炎，太淺則易在滴種時(shí)打噴嚏。2. 用無(wú)菌毛細(xì)吸管吸取病毒懸液少許，連同毛細(xì)吸管插在無(wú)菌試管中備用。3. 用左手將小白鼠握在手掌中，大拇指及食指抓住小白鼠耳部使其頭部朝前并呈仰臥位置，另一手取事先吸有病毒懸液的吸管，慢慢滴出一點(diǎn)于滴管口而不使其自然掉落，呈懸滴狀。將懸滴靠近動(dòng)物鼻尖，動(dòng)物在呼吸時(shí)自然吸入，一般為0.030.05毫升，不宜過(guò)多。4. 小白鼠慢慢蘇醒，在飼養(yǎng)盒中逐日開(kāi)始發(fā)病，發(fā)病的癥狀常為毛聳、咳嗽、不食、甚至死亡。解剖尸體可觀(guān)察到肺炎或血性病灶。（三）小白鼠腦內(nèi)接種（錄像）【材料】腦炎病毒（小白鼠腦脊髓炎病毒）懸液。腦組織先用無(wú)菌生理鹽水洗去血液，再加10脫脂奶鹽水研磨成101懸液，然后用3000轉(zhuǎn)/分離心沉淀30分鐘，吸取上清液供接種用。小白鼠：3周齡，體重68克。無(wú)菌0.25毫升注射器及針頭（4號(hào)）、煮針鍋、碘酊、棉簽。【方法】1. 以無(wú)菌0.25毫升注射器抽取腦炎病毒懸液0.1毫升，去除注射器內(nèi)的氣泡。2. 取出小白鼠，左手將小白鼠固定，固定時(shí)用大拇指和食指捏住小白鼠的頭部，左手手掌輕輕按住小白鼠的體部。3. 右手以棉簽蘸以碘酒，消毒小白鼠顳部皮毛（不碰到眼）。4. 右手拿注射器在小白鼠顳部（眼與耳根連線(xiàn)的中點(diǎn)略偏耳朵的方向）刺入，進(jìn)入顱腔，進(jìn)針23毫米，不要插得太深，注射量為0.020.03毫升。5. 注射完畢，將用過(guò)得注射器放入煮針鍋內(nèi)煮沸消毒。動(dòng)物一般在34天后開(kāi)始發(fā)病，食欲減退，活動(dòng)遲鈍，毛聳，震顫，慢慢發(fā)展為麻痹，癱瘓而死亡。本法適用于一些腦炎病毒的分離培養(yǎng)。三、 病毒雞胚培養(yǎng)法雞胚培養(yǎng)法常用于痘類(lèi)病毒、粘病毒和皰疹病毒的分離、鑒定、制備抗原、生產(chǎn)疫苗以及研究病毒性質(zhì)等。雞胚和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一樣，為一整體動(dòng)物，有神經(jīng)血管的分布及臟器的構(gòu)造；雞胚的組織分化程度低，病毒易于繁殖，感染了病毒的膜結(jié)構(gòu)和液體中，含有大量病毒；雞胚來(lái)源充足，操作簡(jiǎn)單、通常本身是無(wú)菌的，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體為其優(yōu)點(diǎn)，但除產(chǎn)生痘皰的病毒及引起雞胚死亡的病毒外，通常不產(chǎn)生特異性的感染指征，必須利用第二個(gè)試驗(yàn)系統(tǒng)來(lái)測(cè)定病毒的增殖。常用的雞胚接種方法有四種，即絨毛尿囊膜上接種法、羊膜腔接種法、尿囊接種法及卵黃囊接種法。根據(jù)不同病毒和不同目的采用合適的接種方法。（一）尿囊腔接種法（錄像）【材料】副流感病毒103稀釋液，1012日齡雞胚、無(wú)菌1毫升注射器及7號(hào)針頭、電動(dòng)磨蛋器、檢蛋燈、彎頭小鑷子、蛋架、碘酒棉球、膠布、大頭針、無(wú)菌試管、無(wú)菌毛細(xì)吸管。【方法】1. 選用1012日齡雞胚，在照蛋燈上照視觀(guān)察雞胚是否存活，根據(jù)如下：小血管是否清晰；胚胎是否活動(dòng)，觀(guān)察小雞的眼睛黑點(diǎn)是否移動(dòng)；蛋白一邊和胎盤(pán)一邊是否界限分明，蛋白一邊較亮，胎盤(pán)一邊暗紅色，如果胎盤(pán)一邊發(fā)黑或蒼白都表示胚蛋已死亡。用鉛筆標(biāo)明天然氣室，雞胚及大血管位置，然后在絨毛尿囊膜發(fā)育區(qū)避開(kāi)大血管的地方作一記號(hào)，定為注射入口。絨毛尿囊膜區(qū)血管豐富，在照視時(shí)呈現(xiàn)紅色，幾乎占據(jù)雞蛋的二分之一。2. 用碘酒消毒注射入口和天然氣室端的蛋殼，再用電動(dòng)磨蛋器于注射入口和天然氣室端的蛋殼上磨一小孔，勿傷及卵膜。3用大頭針通過(guò)火焰消毒后刺穿氣室端所開(kāi)小孔的卵膜，這樣可避免在注射時(shí)液體回流出來(lái)。4將雞胚橫臥于蛋架上，用無(wú)菌1毫升注射器抽取病毒液體，針頭于卵殼成30交角，由注射小孔刺入0.51.0厘米，注射0.10.2毫升（圖10-1）。5注射完結(jié)用膠布封口。封口前膠布用碘酒消毒，并通過(guò)火焰燒去余碘。用過(guò)的注射器用煮沸法消毒，雞胚放入3537培養(yǎng)。6注射后次日，逐日觀(guān)察雞胚生活情況，孵育4872小時(shí)后移入4冰箱。注意雞胚必須直立，令氣室端朝上。7收獲尿囊液之前取出雞胚，用碘酒消毒氣室端，并用鑷子擊破氣室端卵殼，沿氣室邊緣小心打開(kāi)一大缺口，然后用小鑷子撕去卵膜及撕破絨毛尿囊膜，最后用毛細(xì)管吸取尿囊液，一般可吸得45毫升。8滴定尿囊液的病毒血凝效價(jià)。尿囊接種法適用于某些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒、新城雞瘟病毒等的培養(yǎng)，惟分離培養(yǎng)不如羊膜腔接種法陽(yáng)性率高。羊水卵白氣室卵黃囊尿囊液圖 10-1 雞胚尿囊腔接種法（二）絨毛尿囊膜上接種法（錄像）【材料】牛痘苗病毒103稀釋液、1013日齡雞胚、橡皮乳頭、眼科鑷子或小剪刀、無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌生理鹽水，其余同尿囊腔接種法?！痉椒ā?選用1013日齡雞胚，在照蛋燈上照視觀(guān)察是否活胚蛋，用鉛筆劃下絨毛尿囊膜發(fā)育的界限。2將胚蛋橫臥于蛋座上，使其絨毛尿囊膜部位朝上，用碘酒消毒絨毛尿囊膜部位和天然氣室端的中心部，待干后即用磨蛋器輕輕在絨毛尿囊膜中心部磨一三角形窗口（每邊一厘米許），磨破卵殼而不使卵膜破裂，同時(shí)用磨蛋器于氣室端開(kāi)一小孔。注意：已磨好之雞胚必須于12小時(shí)內(nèi)接種，否則絨毛尿囊膜易與卵殼粘著。3用分離針或大頭針通過(guò)火焰消毒，穿通天然氣室端所鋸小孔；并用分離針或大頭針輕輕劃破卵殼，露出三角形卵膜，最好將分離針或大頭針30角度自上往下壓迫卵膜一個(gè)小口，這樣不致?lián)p傷絨毛尿囊膜。4立即用橡皮乳頭在天然氣室一端小孔吸氣23次，目的將天然氣室的空氣吸去，而上面所開(kāi)的洞口進(jìn)入空氣，形成一個(gè)人工氣室，可在照蛋燈上照視一下，看天然氣室是否消失，如未消失則尚需再吸氣數(shù)次（圖10-2）。5用小鑷子通過(guò)火焰滅菌，稍待冷卻后將三角形窗口的卵膜撕去、暫時(shí)蓋以無(wú)菌培養(yǎng)皿防止污染，然后用消毒注射器吸取牛痘苗懸液（103稀釋液，內(nèi)加適量的鏈霉素及青霉素），揭去培養(yǎng)皿，于窗口滴入0.10.2毫升病毒液，注畢后窗口用膠布封口，封口前膠布用碘酒消毒，并通過(guò)火焰，燒去余碘。用過(guò)的注射器煮沸消毒。6孵育于37溫箱，每日觀(guān)察生活情況，接種103稀釋的牛痘苗后的雞胚一般不死亡，但也可能在3天之后發(fā)生死亡，如發(fā)現(xiàn)死亡則立即放入普通冰箱，如不死亡則培養(yǎng)45日后放入普通冰箱，等待觀(guān)察檢查。7將感染病毒的雞胚自冰箱中取出，用碘酒消毒人工氣室面，然后用鑷子撕去膠布并將卵殼的三角形窗口擴(kuò)大，以便剪取絨毛膜，此時(shí)在明亮處可清楚地看到牛痘斑，呈白色點(diǎn)狀，有時(shí)融合成一堆或一片。8左手用小鑷子鑷起絨毛尿囊膜，右手用小剪順卵殼四周剪下絨毛尿囊膜放入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，并用無(wú)菌生理鹽水洗滌12次，再將膜張開(kāi)，膜上牛痘斑就看得更為清楚。絨毛尿囊膜上接種法，除適用于天花，牛痘等病毒外，尚適用于單純皰疹病毒和其它一些病毒，但其它一些病毒不如天花、牛痘、單皰疹病毒那樣具有明顯的病斑。絨毛尿囊膜羊水卵白卵黃囊尿囊液圖10-2 雞胚絨毛尿囊膜上接種（三）羊膜腔接種法（錄像）【材料】副流感病毒103稀釋液、910日齡雞胚、滅菌液體石蠟、其余同尿囊腔接種法?！痉椒ā?所用雞胚在使用前一天，將雞胚直立卵盤(pán)培養(yǎng)，使其胚胎向上，便于操作。 2接種前檢查雞胚生活情況，并用鉛筆畫(huà)出天然氣室和胚胎的位置，然后用磨蛋器沿天然氣室的邊緣和胚胎位置近處，鋸一方形小窗（每邊約1厘米許，如圖10-3）。3用小鑷子挑去方形卵殼和撕去卵膜，再用無(wú)菌吸管，吸取石蠟油少許，滴入2滴，石蠟油在氣室面的卵膜上很快散開(kāi)，使膜透明，這樣在雞蛋照明燈或檢蛋燈上，可清楚地觀(guān)察到整個(gè)雞胚。4用無(wú)菌1毫升注射器抽取少許流感病毒液體，將雞蛋直立于照明燈或檢蛋燈上，針頭自窗口對(duì)著雞胚直下，穿過(guò)絨毛尿囊膜，羊膜腔、推動(dòng)注射器，注入0.10.2毫升，針頭刺入時(shí)注意勿傷及雞胚本身，最好從小雞的頸部空隙中插入。5注射完畢后，用膠布封口（膠布先經(jīng)碘酒消毒和通過(guò)火焰燒去余碘處理）。用過(guò)的注射器煮沸消毒處理。雞胚放入3537培養(yǎng)4872小時(shí)。6自注射后次日起逐日檢查雞胚的生活情況，2日以?xún)?nèi)死亡者多為非特異性損傷而致死；2日后死亡者視為特異性死亡，流感或副流感病毒103稀釋注射時(shí)，一般不引起死亡。收獲病毒之前將雞胚移入普通冰箱1824小時(shí)，將雞胚凍死，以減少收獲時(shí)的出血。7冰箱取出雞胚，碘酒消毒雞蛋氣室端，撕去膠布并將蛋殼窗口擴(kuò)大，用小鑷子撕破卵膜及絨毛尿囊膜，然后用毛細(xì)管吸出尿囊液棄去，尿囊液吸完后，左手持鑷子鑷住羊膜腔，右手以毛細(xì)吸管插入羊膜腔吸取羊水，一般羊水可吸出一毫升左右。8滴定羊水的病毒血凝效價(jià)。羊膜腔接種方法適用于一些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒及流行性腮腺炎病毒等的分離。 卵黃囊氣室卵白羊水尿囊液圖 10-3羊膜腔接種法四、病毒細(xì)胞培養(yǎng)法及病變觀(guān)察（錄像）細(xì)胞培養(yǎng)法是目前培養(yǎng)病毒應(yīng)用最廣的一種培養(yǎng)方法，其優(yōu)點(diǎn)是（1）經(jīng)濟(jì)適用，結(jié)果正確且敏感；（2）較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物易于控制。細(xì)胞培養(yǎng)法多應(yīng)用于病毒的分離培養(yǎng)，進(jìn)行血清中和試驗(yàn)及制造疫苗和抗原等方面。很多組織細(xì)胞，包括雞胚、鼠胚、各種動(dòng)物的腎組織細(xì)胞，人胚羊膜組織細(xì)胞或流產(chǎn)胎兒組織細(xì)胞（應(yīng)在死后6小時(shí)內(nèi)采取，因時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，組織細(xì)胞生長(zhǎng)成功率下降）等均可作細(xì)胞培養(yǎng)的來(lái)源。細(xì)胞的選擇主要依據(jù)組織細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性。能引起病變的組織細(xì)胞，往往取自病毒的自然宿主，特別是引起疾病的宿主的某些臟器組織細(xì)胞。人類(lèi)病毒，用人或猴的組織細(xì)胞較敏感，但這不是絕對(duì)的，如地鼠腎細(xì)胞較人腎細(xì)胞對(duì)流行性乙型腦炎病毒敏感。（一） 原代細(xì)胞培養(yǎng)法【材料】910日齡雞胚、Hanks氏溶液、0.25胰酶溶液、無(wú)菌小剪、鑷子、無(wú)菌培養(yǎng)皿、毛細(xì)吸管、吸管、沉淀管、無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)管（抗生素空瓶）、100毫升無(wú)菌玻璃瓶或三角燒瓶、備有四層紗布的玻璃漏斗?！痉椒ā?用碘酒消毒雞胚蛋氣室外殼，并將它直立于蛋架上，以鑷子將雞胚取出放入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，去頭爪及內(nèi)臟。2用小剪在培養(yǎng)皿內(nèi)將胚胎剪成小塊（45毫米3），加Hanks氏溶液（約10毫升）沖洗，靜置12分鐘后，用毛細(xì)吸管吸取液體。依同法再洗滌2次，將血球充分洗去。3用鑷子將組織塊放入無(wú)菌玻璃瓶或三角燒瓶?jī)?nèi)，加入1015毫升0.25胰酶溶液，37水浴20分鐘，中間搖動(dòng)幾次。由于胰酶的作用可使大量細(xì)胞游離，液體變混。經(jīng)四層紗布過(guò)濾后的細(xì)胞懸液，低速離心沉淀（1000轉(zhuǎn)/分以?xún)?nèi)）5分鐘，吸取上清液，沉淀物加入適量營(yíng)養(yǎng)液，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，使成每毫升含5080萬(wàn)細(xì)胞懸液以作單層細(xì)胞培養(yǎng)。4每一細(xì)胞培養(yǎng)管，注入細(xì)胞懸液1毫升，蓋好瓶塞，并將瓶略加搖動(dòng)，橫臥于有槽木架上，使細(xì)胞均勻平鋪于管壁。置37溫箱孵育，一般4小時(shí)，細(xì)胞附著于管壁，48小時(shí)可長(zhǎng)成單層，此時(shí)即可調(diào)換營(yíng)養(yǎng)液，接種病毒。（二） 傳代細(xì)胞培養(yǎng)法從人及動(dòng)物組織，特別是腫瘤組織，經(jīng)過(guò)多次傳代可建立傳代細(xì)胞系。這種細(xì)胞能無(wú)限地傳代，但并不是所有的組織細(xì)胞都能建立傳代細(xì)胞。有一些傳代細(xì)胞對(duì)病毒敏感范圍較廣，曾被利用作病毒的分離和鑒定。如HeLa細(xì)胞，Hep2細(xì)胞及KB細(xì)胞。HeLa細(xì)胞對(duì)脊髓灰質(zhì)炎三型病毒，腺病毒及大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)的ECHO病毒都敏感。Hep2細(xì)胞也曾用來(lái)分離脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A組病毒、腺病毒、RS病毒。HeLa細(xì)胞來(lái)自子宮頸癌，Hep2細(xì)胞來(lái)自喉癌，而KB細(xì)胞來(lái)自上腭癌。由于傳代細(xì)胞有致腫瘤作用，目前僅用做病毒的分離鑒定及一些病毒學(xué)的研究而不能用于疫苗的生產(chǎn)。【材料】單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶，營(yíng)養(yǎng)液，0.25胰蛋白酶溶液，無(wú)菌吸管，無(wú)菌細(xì)胞瓶?！痉椒ā?將成片細(xì)胞的生長(zhǎng)液倒掉，用Hanks液洗一次。2加入適量的0.25胰蛋白酶，37孵育1分鐘。3將細(xì)胞瓶倒放，細(xì)胞在上，胰酶在下，繼續(xù)孵育37510分鐘。4將胰蛋白酶倒掉，再加入原量的生長(zhǎng)液，用10毫升吸管吹打分散細(xì)胞。5用生長(zhǎng)液按原量34倍稀釋?zhuān)匆黄考?xì)胞能傳34瓶。（三） 細(xì)胞培養(yǎng)接種病毒的方法及病變觀(guān)察（示教）【材料】單層細(xì)胞培養(yǎng)管、營(yíng)養(yǎng)液、Hanks溶液、無(wú)菌毛細(xì)滴管和腺病毒稀釋液?！痉椒ā?取已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶二只，用無(wú)菌毛細(xì)滴管吸去管中液體，用Hanks溶液洗二次。2用無(wú)菌的1毫升吸管吸稀釋的腺病毒液0.1毫升加入一只單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，另一只加0.1毫升營(yíng)養(yǎng)液不接種病毒作為對(duì)照，細(xì)胞瓶放平，使其接觸整個(gè)細(xì)胞層，置37作用1小時(shí)，使病毒吸附到細(xì)胞上。3取出單層細(xì)胞瓶，每只中加入營(yíng)養(yǎng)液0.9毫升，蓋緊后置37孵箱中培養(yǎng)12天。4取出細(xì)胞在低倍顯微鏡下觀(guān)察，注意種毒與對(duì)照二管的細(xì)胞形態(tài)，排列等。注：為方便保存，此處觀(guān)察的細(xì)胞已經(jīng)過(guò)固定和染色。五、血凝抑制試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)系利用血凝素特異性抗體與病毒表面相應(yīng)血凝素相互作用，使病毒血凝現(xiàn)象抑制的試驗(yàn)。血凝抑制試驗(yàn)適用于具有血凝素的病毒，試驗(yàn)必須預(yù)先滴定病毒的血凝效價(jià)，然后采用一定量的病毒，通常是加入4個(gè)血凝單位的病毒，在與血凝滴定試驗(yàn)相同的反應(yīng)條件下來(lái)進(jìn)行測(cè)定。（一）血凝效價(jià)的滴定【材料】收獲的尿囊液（病毒懸液）、32孔有機(jī)玻璃板。0.2 ml移液器、移液頭、小試管一支、0.5雞紅細(xì)胞懸液、生理鹽水【方法】按下表進(jìn)行，其操作程序?yàn)椋?將有機(jī)玻璃板孔從110號(hào)進(jìn)行編號(hào)，從第一孔起直至第10孔，每孔加生理鹽水0.2ml。2將尿囊液在試管中作15稀釋?zhuān)次?.8ml生理鹽水，加入0.2ml尿囊液。然后吸取15稀釋的尿囊液0.2 ml加入到第1孔，混勻后（吹吸3次），從中吸出0.2 ml移入第2孔，如此對(duì)倍稀釋直至第9孔，于第9孔中吸出0.2 ml，棄入消毒缸內(nèi)。第10孔不加尿囊液作為對(duì)照。3自第10孔起，反方向每孔補(bǔ)充生理鹽水0.2 ml。1 自第10孔起，反方向每孔加入0.5 雞紅血球0.4 ml，搖勻后放室溫靜止45分鐘，觀(guān)察結(jié)果，并確定血（球）凝（集）效價(jià)。孔 號(hào)12345678910生 理 鹽 水（ml）尿 囊 液（ml）0.2+0.2 *0.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.20.2棄去病 毒 稀 釋 度11 012 014 018 01160132016401128012560對(duì) 照補(bǔ) 充 液（ml）（生 理 鹽 水）各 0.20.5 雞 紅 細(xì) 胞懸 液（ml ）各 0.4*為15稀釋尿囊液結(jié)果觀(guān)察：凡出現(xiàn)凝集者，紅細(xì)胞平鋪孔底，呈倒張的傘狀，邊緣有卷起的趨向。凝集特別顯著者為，次之為，凝集清楚可見(jiàn)者為，稍呈凝集者為；陰性者血球沉于孔底中心，呈鈕扣狀。血凝效價(jià)：指呈現(xiàn)凝集時(shí)病毒的最高稀釋度。此時(shí)的稀釋度即為1個(gè)血凝單位。若1個(gè)血凝單位為1640，則4個(gè)血凝單位為1160。（二）血凝抑制試驗(yàn)【材料】4個(gè)血凝單位的病毒液，15稀釋的抗血清，32孔有機(jī)玻璃板，0.2 ml移液器，移液頭，0.5雞紅細(xì)胞懸液，生理鹽水【方法】按下表進(jìn)行，其操作程序?yàn)椋?將有機(jī)玻璃板孔從110號(hào)進(jìn)行編號(hào)，從第一孔起直至第9孔，每孔加生理鹽水0.2ml，第10孔加0.4ml。2于第1孔和第8孔中各加入15稀釋血清0.2ml。將第1孔混勻后從中吸出0.2ml移入第2孔，如此作對(duì)倍稀釋直至第7孔，于第7孔中吸出0.2ml棄入消毒缸內(nèi)。第8孔為血清對(duì)照。3于第1至第7孔中各加入0.2ml 4個(gè)血凝單位的病毒液，第9孔亦加入0.2ml病毒液作病毒對(duì)照。4稍加振搖后，每孔加入0.5雞紅細(xì)胞0.4ml，室溫靜置45分鐘，觀(guān)察結(jié)果。孔 號(hào)1234567血 清 對(duì) 照病 毒 對(duì) 照紅 細(xì) 胞對(duì) 照生 理 鹽 水（ml）抗 血 清 （ml）0.20.2 *0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2 0.2 0.2棄去0.20.2 *0.2 0.4 血 清 稀 釋 度110120140180116 013 2016404 個(gè) 血 凝 單 位 病 毒（ml）各 0.2 0.2 0.5 雞 紅 細(xì) 胞 懸 液（ml）各 0.4*為15稀釋的抗血清結(jié)果：紅 細(xì) 胞 對(duì) 照 孔 ，血球沉于孔底中心，呈鈕扣狀，表明紅細(xì)胞無(wú)自凝現(xiàn)象；病毒對(duì)照孔，呈現(xiàn)凝集，表明病毒血凝功能正常；血清對(duì)照孔，血球沉于孔底中心，呈鈕扣狀，表明血清中無(wú)凝集因子；測(cè)定孔中，如血球沉于孔底中心，呈鈕扣狀，表明血清中有相應(yīng)的血凝抑制抗體，為陽(yáng)性孔；反之凝集者為陰性孔。血凝抑制效價(jià)：呈完全血凝抑制時(shí)的最高血清稀釋度。附錄：附錄：1雞胚的準(zhǔn)備和發(fā)育過(guò)程病毒的雞胚培養(yǎng)，多采用來(lái)亨雞卵，其優(yōu)點(diǎn)為卵殼色白而薄，易于照視，如不能得到，一般家雞卵也可應(yīng)用。孵育溫度通常在3839之間，相對(duì)濕度4060。孵育45天后即可在檢蛋燈上檢查雞胚受精與否及發(fā)育情況。未受精之雞蛋于4日后僅見(jiàn)模糊卵黃黑影，無(wú)雞胚跡象?；畹碾u胚于4日后即可見(jiàn)清晰之血管小網(wǎng)，中有剛剛發(fā)育之胚胎，自45天以后逐日檢查胚胎生活情況，逐日增大之雞胚則可見(jiàn)到清楚之絨毛尿囊膜上的血管及活動(dòng)之胚胎。受精卵在通過(guò)輸卵管時(shí)，已開(kāi)始分裂，當(dāng)產(chǎn)卵時(shí)已在卵黃中形成細(xì)胞，名為胚點(diǎn)，在適宜溫度下即能繼續(xù)分裂發(fā)育，形成中、外、內(nèi)三胚層，逐步發(fā)育成各種器官。雞胚的最外層為石灰質(zhì)之卵殼，上有細(xì)孔以行氣體交換，下層為殼膜，很容易與孵殼分開(kāi)，殼膜的功能是使氣體分子和液體分子在內(nèi)外兩方面進(jìn)行交換，因此在孵育雞胚時(shí)需要一定的濕度和氣流，如果濕度太低，雞胚就容易脫水，引起雞胚死亡，氣流同樣是重要的，孵育時(shí)如空氣不流通，亦可造成雞胚的死亡。因此殼和殼膜不是簡(jiǎn)單的覆蓋，而是本身具有維持內(nèi)部生命的功能。氣室的功能是呼吸和調(diào)節(jié)壓力，殼膜之下為血管豐富的絨毛尿囊膜，外為絨毛膜，系外胚層形成，內(nèi)為尿囊膜，由內(nèi)胚層形成，兩膜結(jié)合之間為中胚層，因此絨毛尿囊膜是尿囊膜在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中與絨毛膜相連而成，血管較多，起著胚胎呼吸器官的功能，氧氣的交換是在膜的血管內(nèi)通過(guò)卵殼孔而進(jìn)行的。雞胚孵育至第3天即出現(xiàn)尿囊，為直腸腹側(cè)部分的膨出物，尿囊腔是胚胎的排泄器官，內(nèi)含尿囊液，初為透明液體，是單純生理鹽水溶液，以后尿囊液中尿酸鹽迅速增加，胚胎發(fā)育到第1213天，尿囊液開(kāi)始變得渾濁，若將其冷卻即可見(jiàn)有沉淀物形成，主要是尿酸鹽類(lèi)。因此，在制備流感病毒抗原時(shí)，通常用鹽水將尿液加以稀釋后放4備用，這樣可減少尿酸鹽的沉淀，尿液量在雞胚發(fā)育的第11至13天最高，平均為66.5毫升。羊膜為胚胎最內(nèi)層包被，系由外胚層組成，羊膜腔盛有羊水，胎體浸泡于其中，羊水在起初是單純的生理鹽水，后來(lái)則蛋白質(zhì)含量增加，羊水量平均為1毫升左右。卵黃囊附著于胚胎，卵黃囊膜系由內(nèi)胚層的細(xì)胞組成，對(duì)培養(yǎng)病毒有重要作用，內(nèi)包有卵黃，為胚胎之養(yǎng)料，卵白位于卵之銳端，為胚胎發(fā)育晚期之養(yǎng)料。2Hanks溶液配制，先配成下列甲、乙兩種原液。原液甲：NaCl160克 KCl8克 加入800毫升雙蒸水MgSO47H2O2克MgCl2H2O2克CaCl2 2.8克溶于100毫升雙蒸水將上述二溶液混合后加雙蒸水至1000毫升，加2毫升氯仿作為防腐劑，保存于4冰箱。原液乙：Na2HPO412H2O304克KH2PO41.2克 加入800毫升雙蒸水葡萄糖20克04酚紅液 100毫升加入雙蒸水使成1000毫升，加入2毫升氯仿作為防腐劑，保存于4冰箱，使用前按以下比例配成。原液甲1份原液乙1份雙蒸水18份以9磅10分鐘滅菌，此溶液存于4冰箱，可使用1個(gè)月。3營(yíng)養(yǎng)液的配制Hanks液1000毫升水解乳白蛋白5克配制成0.5之水解乳白蛋白溶液，分裝小瓶以9磅10分鐘滅菌，使用前再加入510無(wú)菌牛血清，并調(diào)整pH（用NaHCO3溶液校正）。40.25胰蛋白酶溶液配制胰酶2.5克Hanks使用液1000毫升青霉素10毫升（最終濃度100單位/毫升）鏈霉素10毫升（最終濃度100單位/毫升）加胰酶和抗生素于Hanks液中，震蕩使其溶解，加壓過(guò)濾除菌，分裝，20低溫備用，一瓶最好用一次，不宜反復(fù)凍融。3流感病毒的分離和鑒定過(guò)程：【材料】患者早期漱口液（用大管肉湯收集）、910日齡雞胚、1毫升注射器及針頭（16號(hào)）、抗生素（每毫升含青霉素2萬(wàn)單位及2萬(wàn)微克鏈霉素）、無(wú)菌小試管、吸管、0.5雞紅細(xì)胞、已知各型流感免疫血清?！痉椒ā?病人急性期的漱口液 （抗生素處理） 活雞胚培養(yǎng)（羊膜腔