蛋白質(zhì)芯片技術(shù)PPT課件.ppt

蛋白質(zhì)芯片研究進(jìn)展 SeminarI 1 內(nèi)容提要 蛋白質(zhì)芯片概述蛋白質(zhì)芯片的關(guān)鍵技術(shù)蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用展望 2 蛋白質(zhì)芯片的定義 蛋白質(zhì)芯片 又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列 是指以蛋白質(zhì)分子作為配基 將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列 用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其他它分子與之作用 洗去未結(jié)合的成分 經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度 來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系 MarkusF etal DDT 2002 7 815 822 BertoneP etal FEBSJournal 2005 272 5400 5411 3 研究蛋白質(zhì)芯片的意義 蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物 接近生命活動的物質(zhì)層面 探針蛋白特異性高 親和力強(qiáng) 可簡化樣品前處理 甚至可直接利用生物材料 血樣 尿樣 細(xì)胞及組織等 進(jìn)行檢測 適合高通量篩選與靶蛋白作用的化合物 有助于了解藥物或毒物與其效應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用 4 蛋白質(zhì)檢測芯片蛋白質(zhì)功能芯片 蛋白質(zhì)芯片的分類 PoetzOet al MechanismsofgeingandDevelopment 2005 126 161 170 5 蛋白質(zhì)芯片的關(guān)鍵技術(shù) 提出生物學(xué)問題 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?樣品預(yù)處理 重組蛋白 制備一 二級抗體 熒光標(biāo)記 配蛋白印記緩沖液 生化反應(yīng)化學(xué)偶合 加底物 反應(yīng)溫度和時(shí)間 沖洗條件 檢測 熒光和比色掃描或拍照 參數(shù)設(shè)置 數(shù)據(jù)分析和建模 圖象量化 標(biāo)準(zhǔn)化 采集蛋白信息 建立模型 1 2 3 4 5 蛋白質(zhì)芯片制備 6 SchenaM Proteinmicroarrays 2005 7 6 蛋白質(zhì)芯片的制備 固相載體及其處理載體 滴定板 濾膜 凝膠 載玻片 蛋白質(zhì)的預(yù)處理選擇具有較高純度和完好生物活性的蛋白進(jìn)行溶解點(diǎn)制微陣列可使用點(diǎn)制基因微陣列的商品化點(diǎn)樣儀或噴墨法等 固定微陣列上的蛋白樣點(diǎn)膜為載體 芯片放入濕盒 37 C1h載玻片為載體 化學(xué)修飾產(chǎn)生醛基固定蛋白微陣列的封閉主要封閉試劑 BSA或Gly 李瑤 基因芯片與功能基因組 2004 32 33 7 蛋白質(zhì)芯片比較 表面蛋白固定方式優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn) PVDF吸附無需蛋白修飾過程 高結(jié)合容量非特異吸附 分布隨機(jī)Nitrocellulose吸附無需蛋白修飾過程 高結(jié)合容量非特異吸附 高背景 低密度無需蛋白修飾過程 高密度 非特異吸附 分布隨機(jī)高分辨檢測Epoxy activated高密度 高分辨檢測分布隨機(jī) 表面有吸附PDMSnanowell高密度 適合復(fù)雜的生化分析Goldcoatedsilicon高密度 低背景 易與SPR或MS聯(lián)用分布隨機(jī) 制作難 未商品化Avidincoated親和結(jié)合蛋白連接強(qiáng)度高 特異和高密度 低背景蛋白需生物素化Ni NTAcoated親和結(jié)合蛋白連接強(qiáng)度高 特異和高密度 低背景蛋白需Hisx6標(biāo)記表面蛋白分布均一容量Agarosethinfilm制作難 未商品化3Dgelpad 吸附 共價(jià)偶聯(lián) Poly lysinecoatedAldehyde coated 共價(jià)偶聯(lián) 擴(kuò)散無需蛋白修飾過程 高結(jié)合容量 ZhuHet al CurrentOpinioninchemicalBiology 2003 7 55 63 8 蛋白質(zhì)芯片檢測 探針標(biāo)記檢測法 無探針標(biāo)記檢測法 表面增強(qiáng)激光解吸離子化技術(shù) Surfaceenhancedlaserdesorption ionization SELDI 表面等離子體共振檢測技術(shù) surfaceplasmonresonance SPR 原子力顯微鏡檢測技術(shù) atomicforcemicroscope AFM 同位素標(biāo)記檢測熒光標(biāo)記檢測化學(xué)發(fā)光檢測酶免疫標(biāo)記檢測膠體金標(biāo)記檢測 9 蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用 疾病診斷和預(yù)警藥物開發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué) 10 定量檢測組織提取液中的腫瘤標(biāo)記物 WeissensteinU Proteomics2006 6 1427 1436 孵育后的微陣列熒光圖A含抗原B無抗原 微陣列方法與ELISA方法檢出結(jié)果比較 疾病診斷 uPA尿激酶型纖溶酶原激活因子PAI 1血漿纖溶酶原激活因子抑制因子VEGT血管內(nèi)皮生長因子 11 2020 2 6 12 高通量篩選蛋白 蛋白作用抑制劑 藥物開發(fā) JungSO etal Proteomics2005 5 4427 4431 A1500個(gè)點(diǎn)陣的微陣列B局部點(diǎn)陣放大圖及SPR信號 His6 RB GST E7相互作用抑制劑篩選微陣列圖 加入His6 RB 加入含PepC抑制劑的His6 RB 13 人動脈平滑肌細(xì)胞蛋白譜 SukhanovSandDelafontaineP Proteomics 2005 5 1274 1280 蛋白質(zhì)組學(xué) 揭示了oxidizedlowdensitylipoprotein誘導(dǎo)人動脈平滑肌細(xì)胞的作用模式 細(xì)胞經(jīng)oxidizedlowdensitylipoprotein作用后的蛋白譜 檢出298個(gè)蛋白54個(gè)蛋白表達(dá)量發(fā)生變化 4 7 抗原 一組細(xì)胞 細(xì)胞間相互作用分子 表達(dá)上調(diào) 13 4 抗原 結(jié)構(gòu)蛋白 體液響應(yīng)蛋白 表達(dá)下降 14 存在的問題 成本過高 需一系列昂貴的尖端儀器芯片的標(biāo)準(zhǔn)化問題提高芯片的特異性 簡化樣品制備和標(biāo)記操作程序 增加信號檢測的靈敏度和消除芯片背景對于結(jié)果分析的影響等等 15 展望 蛋白質(zhì)芯片未來的發(fā)展重點(diǎn) 建立快速 廉價(jià) 高通量的蛋白質(zhì)表達(dá)和純化方法 高通量制備抗體并定義每種抗體的親和特異性 改進(jìn)基質(zhì)材料的表面處理技術(shù)以減少蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合 提高芯片制作的點(diǎn)陣速度 提供合適的溫度和濕度以保持芯片表面蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及生物活性 研究通用的高靈敏度 高分辨率檢測方法 實(shí)現(xiàn)成像與數(shù)據(jù)分析一體化 16 參考文獻(xiàn) 1 MarkusF etal DDT 2002 7 815 822 2 BertoneP etal FEBSJournal 2005 272 5400 5411 3 PoetzOet al MechanismsofgeingandDevelopment 2005 126 161 170 4 李瑤 基因芯片與功能基因組 2004 32 33 5 ZhuHet al CurrentOpinioninchemicalBiology 2003 755 63 6 WeissensteinU Proteomics2006 6 1427 1436 7 FangY etal ChemBioChem2002 3 987 991 8 SukhanovSandDelafontaineP Proteomics 2005 5 1274 1280 9 JungSO etal Proteomics2005 5 4427 4431 10 SchenaM Proteinmicroarrays 2005 7 17 謝謝 18 蛋白質(zhì)芯片檢測信號的提高 SaueraU etal SensorsandActuatorsB 2005 107 178 183 優(yōu)化芯片制作過程各種參數(shù) 使用金粒子作為輔助標(biāo)記分子 添加SiO2和TiO2層提高表面反射 Au labelledanti rabbitIgG放大照片 Au的尺寸及其與Dy633的比例對信號的影響5nmAu particle10nmAu particle 19 ProteinMicroarraySystem TheProteinMicroarraySystemisacompletemicroarrayplatformthatincludesmicroarraymanufacturing processing surfacechemistry detectionandanalysis TeleChem ItissuitableforavarietyofproteomicapplicationsincludingMicroMultianalyteImmunoassays protein antibody antibody protein antibody antigen protein protein a