探針設(shè)計原則.docx

原位雜交探針大體可分為三類：寡核苷酸探針，cDNA探針，RNA探針。寡核苷酸探針由25bp左右的核苷酸組成，通?？梢杂晒竞铣桑捎谄湫蛄休^短，因此特異性較強，原位雜交時可以區(qū)分家族基因，同一基因的不同剪切體，cDNA探針長約500bp左右，可以通過非對稱PCR擴增合成，由于探針式DNA，可以有效的避免降解，但DNA和RNA的結(jié)合不如RNA與RNA結(jié)合強，通常不采用，RNA探針長約500bp左右，通過體外轉(zhuǎn)錄合成，如果設(shè)計合理，其特異性是可以得到保證的，其主要缺點是容易被RNAse酶降解。查看原位雜交相關(guān)的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，2000年以前的原位雜交常使用放射性標(biāo)記的寡核苷酸探針，通過膠片曝光來顯色，2000年以后的文獻(xiàn)常使用RNA探針。許多腎臟發(fā)育的文獻(xiàn)雖然有很多原位雜交數(shù)據(jù)，但卻沒有附帶上探針序列或者用于探針模板克隆的引物，通過了解廈門黃老師斑馬魚和昆明毛炳宇爪蟾中原位雜交探針設(shè)計方法，我們可以采用RNA探針。文獻(xiàn)中很難找到關(guān)于RNA探針設(shè)計的原則，有的文獻(xiàn)報道直接用cDNA合成RNA探針。借鑒爪蟾中原位雜交探針設(shè)計流程，以小鼠FGF10的探針設(shè)計為例進(jìn)行介紹。1. 在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載該FGF10的mRNA全序列，然后用FGF10的全長在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析，比對數(shù)據(jù)庫選擇mouse genome+transcript，比對程序選擇somewhat similar sequence。 Zebrafish seqRNAs得出的比對結(jié)果中有一幅圖譜，顯示比對序列與數(shù)據(jù)庫中序列的相似性，探針應(yīng)設(shè)計在與其它基因不存在明顯相似性的區(qū)段，在比對結(jié)果的圖譜中選擇可變區(qū)。如下圖黑色框區(qū)域。2. 估計黑色框堿基在FGF10 mRNA中的大致范圍，在這個范圍內(nèi)選擇長約500bp的序列設(shè)計探針。根據(jù)上圖信息，我們選擇FGF1030003800的范圍進(jìn)行探針設(shè)計。agcac agaggcacaa tgctttggtt tatgggtata ggttgcattt 3301 tgtggtgttc tttcaacttg ttttctgaca aatgggattt ttaaaatgta tacttcttgt 3361 ggttggattc tgtatgttag agtttaattg gtaactgagt ctaaaggctc taatgtaatg 3421 aatctctaga agaactaggt atcttttttt acttttattt taaaataata attatacctg 3481 acacatgacc atggaccacc cacaaccaaa attaaatgtt tggggagaca aactatagta 3541 ttcagtgaca agggtaacag caaatagtgc agacgttgga ttcttatttc actttgccat 3601 ttagattact aaagagacta tgtgtaaaca gtcatcatta tagtactcaa gacattaaac 3661 agcttctagc aaaatgtatc aaagcttgca gagtccaaaa atagaaaaca tctttccccc 3721 tctcccaccc tacatttccc cctgtatgca tcctaacaga gat底紋標(biāo)注的為引物序列3. 將設(shè)計好的探針序列在UCSC上再次比對分析，genome選擇mouse，query type選擇translated RNA，點擊submit，保證搜索出的條目只有目標(biāo)基因，如果存在其它非目標(biāo)匹配項（既不是來自FGF基因的序列），則需要重新選擇一段探針序列。你可以點擊browser瀏覽一下所設(shè)計的探針序列是否是FGF10的序列以及所在位置。在選擇探針序列時，盡量選擇3端的區(qū)域，避開可能的選擇性剪切，同時也要避免mRNA的末端序列，因為可能存在翻譯終