高速逆流色譜技術(shù) 綜述.doc

高速逆流色譜技術(shù)1.概述高速逆流色譜（high-speed counter current chromatography，簡稱 HSCCC），是20世紀70年代由美國國立衛(wèi)生院（National Institute of Health，簡稱NIH）Ito博士首創(chuàng)，并且在最近10年之內(nèi)發(fā)展迅速，是一種可在短時間內(nèi)實現(xiàn)高效分離和制備的新型液-液分配色譜技術(shù)，這項技術(shù)可以達到幾千個理論塔板數(shù)的。它具有操作簡單易行、應(yīng)用范圍很廣、無需固體載體、產(chǎn)品純度高、適用于制備型分離等特點。自1982年第一臺儀器問世，就開始了HSCCC的現(xiàn)代化進程。HSCCC用于天然藥物化學成分的分離始于1985年，到1989年達到一個高潮。自2000年9月起國際逆流研究領(lǐng)域每隔2年舉行一次世界逆流色譜學術(shù)會議。近幾年, 人們對健康的認識越來越深刻, 更多的人追求天然綠色的健康理念, 故HSCCC 作為一種對提取物污染小的制備技術(shù), 它的應(yīng)用越來越受到了人們的關(guān)注。鑒于HSCCC的顯著特點, 此項技術(shù)已被應(yīng)用于生化、生物工程、醫(yī)藥、天然產(chǎn)物化學、有機合成、環(huán)境分析、食品、地質(zhì)、材料等領(lǐng)域。目前,HSCCC已從制備型發(fā)展到了分析型, 甚至是微量分析型, 應(yīng)用范圍也十分廣泛 2。高速逆流色譜技術(shù)在我國的應(yīng)用較早, 技術(shù)水平在國際領(lǐng)域也處于領(lǐng)先地位。目前, 我國是世界上為數(shù)不多的高速逆流色譜儀生產(chǎn)國之一。我國的深圳同田生化技術(shù)有限公司是全球第一家多分離柱高速逆流色譜儀專業(yè)生產(chǎn)企業(yè)。公司擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的高速逆流色譜專利技術(shù), 現(xiàn)已研制并生產(chǎn)出TBE 系列分析型, 半制備型TBE 300，300A, 制備型TBE1000高速逆流色譜儀設(shè)備。2.基本原理高速逆流色譜技術(shù)(HSCCC)是一種不用任何同態(tài)載體的液-液色譜技術(shù)，其分離原理是進行分離純化時，首先選擇預(yù)先平衡好的兩相溶劑中的一相為固定相, 并將其充滿螺旋管柱, 然后使螺旋管柱在一定的轉(zhuǎn)速下高速旋轉(zhuǎn), 同時以一定的流速將流動相泵入柱內(nèi)。在體系達到流體動力學平衡后(即開始有流動相流出時), 將待分離的樣品注入體系, 其中組分將依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同實現(xiàn)分離。HSCCC分離效率高，產(chǎn)品純度高；不存在載體對樣品的吸附和污染；制備量大和溶劑消耗少；操作簡單，能從極復(fù)雜的混合物中分離出特定的組分。高速逆流色譜儀器的裝置如圖1所示，它的公轉(zhuǎn)軸水平設(shè)置，螺旋管柱距公轉(zhuǎn)軸R處安裝，兩軸線平行。通過齒輪傳動，使螺旋管柱實現(xiàn)在繞儀器中心軸線公轉(zhuǎn)的同時，繞自轉(zhuǎn)軸作相同方向相同角速度的自轉(zhuǎn)。圖1 高速逆流色譜儀器的裝置示意圖(引自： 齊元英孟兆玲 柳仁民等 高速逆流色譜技術(shù)及其在天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用進展）在達到穩(wěn)定的流體動力學平衡態(tài)后，柱中呈現(xiàn)兩個絕然不同的區(qū)域：在靠近離心軸心大約有四分之一的區(qū)域，呈現(xiàn)兩相的激烈混合(混合區(qū))；其余區(qū)域兩溶劑相分成兩層(靜置區(qū))，較重的溶劑相在外部，較輕的溶劑相在內(nèi)部，兩相形成一個線狀分界面。如圖2所示：圖2 高速逆流色譜螺旋管溶劑體系的區(qū)域分布圖（引自李愛峰；劉寧寧；柳仁民等高速逆流色譜原理及其在天然產(chǎn)物化學成分分離中的應(yīng)用研究進展 理化檢驗-化學分冊 44(05)，95-98，（2008）圖3為旋轉(zhuǎn)一周混合區(qū)域的變化示意圖，每一混合區(qū)域以與柱旋轉(zhuǎn)速度相同的速度向柱端移動。當流動相恒速通過固定相時，兩相溶劑都在反復(fù)進行混合和靜置的分配過程，這一過程頻率極高，當柱以800 r/min旋轉(zhuǎn)時，頻率超過13次/s，所以高速逆流色譜有相當高的分配效率。（引自李愛峰；劉寧寧；柳仁民等高速逆流色譜原理及其在天然產(chǎn)物化學成分分離中的應(yīng)用研究進展 理化檢驗-化學分冊 44(05)，95-98，（2008）3.儀器裝置經(jīng)過多年的開發(fā)應(yīng)用，高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物以及生物活性樣品的分離分析等領(lǐng)域取得了長足的進步，儀器設(shè)備硬件技術(shù)也得到了顯著的發(fā)展。在逆流色譜技術(shù)發(fā)展的早期階段，人們主要側(cè)重于制備型儀器，近年來又對分析型HSCCC的應(yīng)用報道逐漸增多。由于分析型HSCCC儀器具有體積小、分離速度快、溶劑消耗小等優(yōu)點，因此在溶劑體系的快速優(yōu)化、樣品的小量制備以及分配系數(shù)的測定等方面得到了應(yīng)用。下表比較分析了分析型儀器與制備型儀器及其操作系數(shù)：項目分析型制備型儀器類型J形多層螺旋管離心分析儀J形多層螺旋管離心分析儀螺旋管內(nèi)徑/mm1,到3-4柱體積/ml1.5-5050，最大到1000流速/(ml/min)0.1-12.0-10轉(zhuǎn)速/(r/min)1500-40001200樣品量1g-10mg10mg-10g高速逆流色譜技術(shù)的基本系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖4所示，主要由輸液泵、進樣閥、螺旋管式離心分離管、檢測器等組成。由于其操作壓力并不高，用普通的中低壓泵即可。進樣可用帶有樣品環(huán)管的六通進樣閥進樣。樣品的分離是在多層螺旋管式離心分離管內(nèi)完成。檢測器與液相色譜的檢測器相同，如紫外檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、質(zhì)譜檢測器等。圖4 HSCCC的基本系統(tǒng)結(jié)構(gòu)(引自鄧建朝；肖小華；李攻科等 高速逆流色譜儀器裝置的研究進展，J 化學通報（印刷版）（2009）)圖5為高速逆流色譜原型的橫截面示意圖，由一個電機帶動一對齒形皮帶輪，并由齒形皮帶帶動轉(zhuǎn)動框架，轉(zhuǎn)動框架將管柱支持件和配重組件對稱地裝在離心儀中心軸兩邊，在每一個支持件的軸線上都裝有一個行星齒輪，與中心管上固定齒輪相嚙合，這幾個齒輪的尺寸和形狀完全一樣。為了保證儀器的機械穩(wěn)定性，用一根短偶聯(lián)管同軸地裝設(shè)在轉(zhuǎn)動框架的自由端，偶聯(lián)管地另一頭通過球軸承靠儀器的固定側(cè)壁件支撐，從繞制在支持件上的螺旋管引起的一對流通管，先穿過支持件轉(zhuǎn)軸地中心孔，再穿過偶聯(lián)管的側(cè)孔到達中心固定管地開口，然后穿過此固定管，從儀器地另一端引出。流通管外采用油脂潤滑核塑料套管保護措施，以避免與金屬件直接摩擦。圖5 高速逆流色譜技術(shù)地橫截面示意圖(引自 李攻科、胡玉玲、阮貴華等，樣品前處理儀器與裝置，M 289,(2009) 圖6為改進后的高速逆流色譜儀，這種儀器裝有3個柱支持件，每個支持件上有兩個齒輪，一個與裝在中心離心軸上地行星齒輪相嚙合，另一個與裝在管支持件軸線上地齒輪相嚙合，為避免流通管地打絞，管支持件軸相對于柱支持件做反向轉(zhuǎn)動。 圖6 改進后的高速逆流色譜儀(引自 李攻科、胡玉玲、阮貴華等，樣品前處理儀器與裝置，M 290,(2009)目前，國內(nèi)外商品化的高速逆流色譜技術(shù)儀多為在單柱分離系統(tǒng)的改進型，主要可以分為以下幾類：1、 GS系列 由北京新技術(shù)應(yīng)用研究所張?zhí)煊咏淌陬I(lǐng)導(dǎo)的科研小組研制開發(fā)，是國內(nèi)最早的色譜儀器。主要包括GS10A半制備型HSCCC儀（柱體積為210250 ml，最高轉(zhuǎn)速為1000r/min，單分離柱加配重件結(jié)構(gòu)）以及GS20分析型HSCCC儀（柱體積35ml，最高轉(zhuǎn)速2000r/min），如圖7所示圖7 GS系列HSCCC儀(引自李攻科、胡玉玲、阮貴華等，樣品前處理儀器與裝置，M 301,(2009)2、 TBE系列 由深圳同田生物技術(shù)有限公司負責開發(fā)。包括TBE-300、TBE-300A以及TBE-1000三種類型，如圖8所示.采用三串聯(lián)柱分離系統(tǒng)，其中TBE-300以及TBE-300A的柱體積設(shè)計為300ml，PTFE管徑為1.6mm轉(zhuǎn)速為700-1000r/min，TBE-1000型柱體積為1000ml，PTFE管徑為2.6mm，轉(zhuǎn)速為400-600r/min。 圖8 TBE系列HSCCC儀(引自網(wǎng)頁/Product/detail/50753.html)3、 Quattro系列 由英國Brunel大學生物工程研究所lan Surherland教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組研究開發(fā)。該系列儀器設(shè)計了可以試想自我平衡的爽分離系統(tǒng)，且兩分離柱留有多個聚四氟乙烯管抽頭，用戶可以根據(jù)自己的需要，串聯(lián)或并聯(lián)出不同的柱體積（150ml-3L），同時還可以進行兩個不同的分離過程（如圖9所示）圖9 Quattro系列HSCCC儀(引自李攻科、胡玉玲、阮貴華等，樣品前處理儀器與裝置，M 301,(2009) 另外，美國Pharma Tech Rearch 公司生產(chǎn)逆流色譜技術(shù)儀器也已經(jīng)有十幾年的歷史，如CCC-3000以及CCC-1000型儀器（如圖10所示）均帶有三分離柱串聯(lián)的自平衡系統(tǒng)，柱體積分別為50ml和120-850ml。CCC-1000也可以根據(jù)需要配置不同的分離柱。美國Conway Centrichrom公司生產(chǎn)的DU-1000型，同樣帶有三分離柱，其三柱體積并不相同，分別為480ml、85 ml、245 ml，PTFE管內(nèi)徑為1.6mm。圖10 Pharma Tech Rearch系列HSCCC儀(引自李攻科、胡玉玲、阮貴華等，樣品前處理儀器與裝置，M 301,(2009)4.應(yīng)用HSCCC技術(shù)已經(jīng)成為一種備受關(guān)注的新型分離純化技術(shù)。由于其具有較好的分辨性、固定相不需要載體、進樣量大、分離完全等優(yōu)點，因此被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、天然產(chǎn)物、食品和化妝品等諸多領(lǐng)域。我國還是繼美國、日本之后最早開展逆流色譜應(yīng)用的國家，也是世界上高速逆流色譜儀生產(chǎn)國之一，我國豐富的資源給HSCCC技術(shù)提供了廣闊的平臺。1 高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物領(lǐng)域中的應(yīng)用1.1黃酮類化合物 黃酮類化學物質(zhì)在自然界中廣泛存在于多種植物，且對于治療多種疾病有著重要的作用，是一類比較重要的植物化學成分?，F(xiàn)已成功應(yīng)用HSCCC 技術(shù)分離提純該類化合物的對照品。 常用的分離黃酮類化合物的溶劑系統(tǒng)為氯仿-甲醇-水（4:3:2），例如潘霞等以蘆薈全葉為原料，經(jīng)過一系列的預(yù)處理手段獲得蘆薈色酮粗提物，采用氯仿-甲醇-水(4:3:2)混合溶液和二氯甲烷 -甲醇-水(5:4:2)混合溶液為溶劑分離系統(tǒng)，經(jīng)過兩步HSCCC分離純化出純度在95%以上的蘆薈色酮單體。通過紫外檢測、快原子轟擊質(zhì)譜及核磁共振等方法的結(jié)構(gòu)分析鑒定證實分離所得物質(zhì)為肉桂?；?C-葡萄糖苷蘆薈色酮。Yang F Q等用該體系成功分離了沙棘中的茨非醇。 馬曉豐等采用HSCCC法，以正己烷-氯仿-甲醇-水(1.5:3:3:2)組成的二相系統(tǒng)對黃芪的醋酸乙酯粗提物進行了分離純化，分離出的毛蕊異黃酮純度可達95%以上，并可以初步純化芒柄花素；然后用正己烷-氯仿-甲醇-水 (4:4:5:4)組成的系統(tǒng)進一步純化芒柄花素，其純度達95以上。Du Q Z以正己烷-醋酸乙酯-正丁醇-甲醇-醋酸-水(1:2:1:1:5:1)為溶劑分離了大豆中的黃豆苷、染料木苷，以正己烷-醋酸乙酯 -甲醇-水(1:3:2:4)為溶劑分離了Ampelopsis grossedentata中的（+）二氫楊梅黃酮。 1.2生物堿 大多數(shù)的生物堿都具有較活潑的生物活性，故生物堿的HSCCC提取文獻報道較多。較常用的溶劑系統(tǒng)主要是氯仿-甲醇-酸性改性劑體系。蔣凱等采用HSCCC分離純化黃花烏頭塊根中的生物堿類化學成分，其溶劑系統(tǒng)采用氯仿-甲醇 -0.2 molL-1鹽酸（10:3:3），從黃花烏頭塊根中一次性分離得到8個化合物，其中化合物13- diacetyl-14-hydroxyhetisine為新化合物，命名為關(guān)附未素（Guanfubase R）。洪波等采用HSC- CC對附子中的化學成分進行研究，分離得到了 15-羥基新烏堿單體，溶劑系統(tǒng)為氯仿-甲醇-0.3 molL-1鹽酸（4:3:2）。顏繼忠等以氯仿-甲醇-0.2 molL-1鹽酸(2:1:1)為溶劑體系，用HSCCC成功分離出金果欖中的巴馬亭成分，經(jīng)測定組分純度大于99.6%，并由IR、1H- NMR和MS確定結(jié)構(gòu)。Fuquan Y等利用HSCCC 以氯仿-甲醇-0.3 molL-1鹽酸（4:1.5:2）為溶劑系統(tǒng)，從烏頭的總生物堿粗提物中分離出高烏堿、N-去乙?；邽鯄A。 1.3有機酸 有機酸類是分子結(jié)構(gòu)中含有羧基的一類化合物，在中草藥的葉、根特別是果實中廣泛分布，常見植物中的有機酸有脂肪族的一元、二元、多元羧酸，如酒石酸、草酸、蘋果酸、構(gòu)椽酸、抗壞血酸（即維生素C）等，亦有芳香族有機酸如苯甲酸、水楊酸、咖啡酸等。王鳳美等采用HSCCC，以正己烷 -醋酸乙酯-水-甲醇(1.5:5:5:1.5)為溶劑系統(tǒng)分離純化丹參水溶性成分丹酚酸類物質(zhì)，結(jié)果一次分離可制備63.4mg丹酚酸B，其純度為98.6%。該方法可作為高純度丹酚酸B化學對照品的制備分離方法。黃健光等以正己烷-醋酸乙酯-甲醇 -水(7:3:6:4)為溶劑系統(tǒng)，成功分離了鄰苯二酚和對苯二酚這一對同分異構(gòu)體。孫愛玲等建立了HSCCC分離制備厚樸的有效成分厚樸酚與和厚樸酚的新方法，溶劑系統(tǒng)為石油醚-醋酸乙酯-甲醇-1%醋酸(5:5:7:3)。從l00mg厚樸粗提物制得和厚樸酚33.3mg，厚樸酚19.5 mg，經(jīng)HPLC分析，純度均大于99.5%，其化學結(jié)構(gòu)由1H-NMR和 13C-NMR鑒定。Lu Haitao等應(yīng)用正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)系統(tǒng)從金銀花中分離得到綠原酸。 1.4蒽醌類及其他 陳存社等經(jīng)過分析得出，用氯仿-甲醇- 丙酮-水(9:8:1:8)為溶劑系統(tǒng)分離純化蘆薈有效成分蒽醌類物質(zhì)蘆薈大黃素和蘆薈大黃素苷的效果最佳。袁黎明等對蘆薈的乙醇粗提物在不同的溶劑系統(tǒng)比例下進行了分離，當采用氯仿-甲醇-水 (4:3.8:2)時，分離結(jié)果最好。王春燕等應(yīng)用 HSCCC法，以溶劑系統(tǒng)氯仿-甲醇-水 (9:10.5:8)的上相為固定相，下相為流動相，從蘆薈生藥中一次性分離得到蘆薈苷（純度 99.99%）和蘆薈大黃素（純度95.83%）。實驗中還分離得到一個未知物，其薄層色譜鑒別與蘆薈苷一致，經(jīng)HPLC測定其純度為99.26%，是否為蘆薈苷的異構(gòu)體，有待進一步研究。Yang F Q等用氯仿-甲醇-水(4:3.8:2)分離了虎杖中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷。Weiduo Si等以正己烷- 醋酸乙酯-甲醇-水（2:8:2:8）為溶劑，用HSC- CC技術(shù)對綠茶粗提物中的殺菌成分進行了分離，得到兩個活性成分。Qizhen Du等利用HSCCC技術(shù)從越桔粗提物中提取花青素，從500mg越桔粗提物得到cyanidin-3-O-sambubioside和delphini- din3-O-sambubioside提純品77 mg和130mg,其溶劑系統(tǒng)為三氟乙酸-水-正丁醇-叔丁基甲醚- 乙腈（0.01:5:4:1:1）。2 高速逆流色譜在藥物中的應(yīng)用與傳統(tǒng)的液相色譜法相比較，HSCCC具有分離效率高、溶劑用量少、無吸附、樣品回收率高、重現(xiàn)性好和適用范圍廣等優(yōu)點。由于HSCCC的溶劑系統(tǒng)組成與配比可以是無限多的，理論上何極性范圍的樣品都可用它得到分離；而且HSCCC對樣品的預(yù)處理要求低，僅需簡單的提取，甚至不用前處理都可達到很好的分離效果。它的這種特點非常適用于中藥成分的分離和分析。許多研究證明，HSCCC能分離用HPLC難以分離的成分。Schaufelberger等用正己烷-乙醇-水（體積比為6:5:5）溶劑系統(tǒng)分離含有長春胺、長春辛和長春新堿等的樣品，與用HPLC的分離效果相似，這3種成分之間均能達到基線分離；但采用HSCCC還能將用HPLC難以分離的長春新堿對映異構(gòu)體分開。HSCCC在中草藥研究方面的應(yīng)用尚處在起步階段，目前主要用于中草藥有效成分的分離和標準品的制備。2.1.1制備中藥化學成分對照品國內(nèi)外學者已采用HSCCC技術(shù)分離提純了許多中藥化學成分對照品, 如從金銀花中分離綠原酸（純度94.8%）, 從黃芪中分離異黃酮苷（95%），從紫草中分離紫草寧（98.9%），從二氫楊梅素粗提物中純化二氫楊梅素川(99%), 從虎仗中分離白黎蘆醇(99%), 從肉蓯蓉acleoside（98%），從丹參中分離隱丹參酮（98.8%），從大黃中分離大黃素甲醚、蘆薈大黃酸、大黃酸、大黃粉、大黃素（98%）, 從毛柳苷粗提物中純化毛柳苷（98%）等。2.1.2 分離蛋白質(zhì)和多肽HSCCC用于分離制備蛋白質(zhì)和多肽, 需要強極性并具有較高的粘度的溶劑系統(tǒng), 為了獲得合適的固定相保留值, 大部分都采用X型的CPC。目前, 聚合物雙水相溶劑體系、新型的PCCC以及ICCC的出現(xiàn)和發(fā)展則為成功分離蛋白質(zhì)和多肽提供了有利的條件。用HSCCC分離的有卵白蛋白、乙醇脫氫酶（ADH）、乳酸脫氫酶（LDH）、DNA結(jié)合蛋白、脂蛋白、短桿菌膚、桿菌膚、粘菌素、縮膽囊素等。2.1.3分離抗生素由于可以直接向HSCCC中進粗品, 抗生素的分析和制備分離也可采用。美國FDA及世界衛(wèi)生組織也采用此項技術(shù)作為抗生素成分的分離檢定。HSCCC分離制備抗生素時, 進樣量通常為1mg5g，溶劑系統(tǒng)一般采用疏水性體系。用HSCCC分離的抗生素實例有環(huán)孢菌素、WAP8249A 、伊維菌素、螺旋霉素,、子囊霉素及依羅霉素、道諾紅菌素衍生物、普那霉素、放線菌素、殺念菌素、尼達霉素等。2.1.4 分離手性化合物隨著HSCCC技術(shù)的發(fā)展, 其應(yīng)用范圍逐步拓展。已有用HSCCC分離外消旋對映體手性化合物的報道。如已用于分離擷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等手性氨基酸對映體, 也有報道從紫膠染料、喹啉黃、食品紅等染料中分離手性化合物。隨著高選擇性的手性添加劑的發(fā)現(xiàn), 相信將有更多的手性物質(zhì)通過HSCCC拆分。2.2 在藥物分析中的應(yīng)用2.2.1 HSCCC與其他色譜技術(shù)聯(lián)用進行中藥的定性、定量分析分析型HSCCC與各種檢測器聯(lián)用可以用于中藥化學成分的定性、定量分析, 或者將分析型與制備型HSCCC聯(lián)用。還可以將HSCCC技術(shù)與其他色譜如HPLC、MS和NMR聯(lián)用, 從而充分發(fā)揮HSCCC高速、高效的優(yōu)點與其他色譜靈敏度高的優(yōu)點, 更好地用于中藥的分析鑒定。2.2.2利用HSCCC建立中藥指紋圖譜 中藥質(zhì)量可控是中藥現(xiàn)代化的一個重要內(nèi)容，中藥以及復(fù)方因其復(fù)雜的成分和未明的作用機理，阻礙著中藥現(xiàn)代化的進程。中藥指紋圖譜技術(shù)已成為研究中藥有效成分及作用機理，控制中藥質(zhì)量，推動中藥業(yè)走向世界的關(guān)鍵技術(shù)。HSCCC具有很好的分辨率和重現(xiàn)性，加上不存在固體載體吸咐，對樣品的前處理要求不高或不用前處理，不存在分離過程丟失成分和成分變性的問題，因而可用于中藥有效成分的定性或半定量分析，并整理出中藥材的特征峰和指紋譜，制定標準圖譜，用于中藥的質(zhì)量控制和測定。在高速逆流色譜指紋圖譜研究方面，目前已對大黃、沙棘、何首烏等一些中藥進行了研究。從20世紀90年代以來, HSCCC有關(guān)技術(shù)有了較大的發(fā)展, 且在天然藥物、生物醫(yī)藥研究中獲得了廣泛的應(yīng)用, 也有人研究用HSCCC分離手性化合物的外消旋對映體。有理由相信, HSCCC技術(shù)在藥物的分離鑒別、質(zhì)量控制、定量分析等方面會有更加廣闊的應(yīng)用前景。5.發(fā)展前景與評價5.1 高速逆流色譜技術(shù)的優(yōu)點HSCCC技術(shù)雖僅有20余年的發(fā)展歷史，但作為一種具有獨特優(yōu)勢的液-液分配色譜技術(shù)，HSCCC的發(fā)展可謂迅猛，技術(shù)也日臻全面和完善，在天然產(chǎn)物有效成分的分離純化領(lǐng)域中有著獨特的優(yōu)勢并且獲得了廣泛的應(yīng)用。逆流色譜分離技術(shù)在黃酮類化合物分離純化的應(yīng)用中幾乎沒有限制，可以用于各種黃酮類化合物的分離。這主要是由于HSCCC 技術(shù)有足夠多的兩相溶劑體系以供選擇應(yīng)用，其洗脫方式靈活多樣，既可以使用單一流動相，也可以一次使用不同的流動相，甚至可以使用兩相溶劑同時雙向流動，實現(xiàn)真正連續(xù)的逆流色譜過程。此外，HSCCC 還可以實現(xiàn)多種形式的梯度洗脫過程，既可用于天然植物粗提物的去除雜質(zhì)，也可用于最后產(chǎn)物的精制，甚至直接從未經(jīng)處理的粗提物一步純化得到純品。所有這些優(yōu)點在上面所述的應(yīng)用實例中都有具體體現(xiàn)。作為一種新興的，備受關(guān)注的分離純化技術(shù)，隨著越來越多的研究者的加入，HSCCC 必將得到更加廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。5.2 高速逆流色譜技術(shù)的缺點盡管HSCCC 具有其它色譜分離方法不可替代的優(yōu)點。但是HSCCC 的更廣泛的應(yīng)用還受到一些因素的制約。首先在溶劑體系的選擇上還沒有非常系統(tǒng)、成熟的理論來指導(dǎo)，雖然已經(jīng)有學者建立了幾種經(jīng)驗性的溶劑系統(tǒng)篩選方法，但這些方法均為經(jīng)驗性的規(guī)律總結(jié)，如何選擇一種具有良好分離效果的溶劑體系還依賴于操作者的經(jīng)驗，通常都需要多次實驗才能篩選出較佳的溶劑系統(tǒng)。另外盡管目前的HSCCC 已經(jīng)能實現(xiàn)上百毫克甚至數(shù)十克級的制備分離，但是還未達到數(shù)百克級甚至公斤級的制備能力。此外，HSCCC 在中試規(guī)模和產(chǎn)業(yè)化當中的應(yīng)用還需要對逆流色譜的分離機理從理論上做更深入的探討，還需要解決現(xiàn)有儀器設(shè)備在放大過程中的一些關(guān)鍵性技術(shù)問題。目前，已有科技人員著手這方面的研究，相信在不久的將來HSCCC 將發(fā)展成為一種更加成熟的可產(chǎn)業(yè)化的高效分離技術(shù)。5.3 高速逆流色譜的應(yīng)用前景5.3.1 HSCCC 的微型化以及與多種分析技術(shù)的聯(lián)用近年來, 分析型HSCCC的柱系統(tǒng)越來越向微型化發(fā)展, 如螺旋管柱體積可小到35mL, 柱內(nèi)徑小到0.30.4mm, 并可以通過各種接口技術(shù)與多種檢測器和化合物結(jié)構(gòu)分析技術(shù)相結(jié)合。尤其是HSCCC與MS的聯(lián)用,把HSCCC分離的靈活性、多樣性與MS的高靈敏度檢測和結(jié)構(gòu)分析特性良好地結(jié)合在一起,在天然活性成分的快速分離和鑒定方面顯示了其獨特的優(yōu)勢, 很有發(fā)展前景。同時,要將HSCCC 發(fā)展成為一種高通量分離技術(shù), HSCCC的微型化也是必需的。5.3.2 HSCCC 在藥物工業(yè)化制備方面的應(yīng)用和發(fā)展HSCCC 從根本上是一種制備性色譜分離技術(shù), 目前實驗室HSCCC的制備能力已經(jīng)達到中試HPLC 的制備規(guī)模。HSCCC 與HPLC的放大過程相比, 其分離過程簡單,所用溶劑量比HPLC 要少75%,且所得目標成分在分離級分中的濃度較高, 易于回收或作進一步的處理。HSCCC 的放大過程不會改變其分離原理。分離過程可以采用典型的色譜理論很好地進行描述和模型化。這種分離過程的可預(yù)測性、分離物質(zhì)的高回收率以及不用固體支撐體等優(yōu)點, 使得HSCCC成為一種可用于工業(yè)化分離的很有前途和吸引力的分離制備方法。但是, 逆流色譜的真正工業(yè)化應(yīng)用還有很多的問題需要研究解決。大制備量儀器的研制首先要搞清放大倍數(shù)、產(chǎn)量、分離效率與柱體參數(shù)的關(guān)系, 在理論指導(dǎo)下進行有目的的可預(yù)測的放大。近年來, 英國B runel大學生物工程研究所的Sutherland教授研究小組及其合作者在這方面進行了一系列的研究, 他們對一些試驗樣品的分離, 在分離柱體積從5mL放大到5L, 上樣量擴大1000倍的情況下, 可以幾乎在同樣的時間( 10m in)內(nèi)，實現(xiàn)同等效率的分離結(jié)果, 分離譜圖基本吻合, 為HSCCC儀器的工業(yè)化放大奠定了良好的基礎(chǔ)。5.3.3 HSCCC 在生物藥物高效分離中的應(yīng)用和發(fā)展HSCCC 在大環(huán)內(nèi)酯類和環(huán)肽類等抗生素藥物的分離制備中的應(yīng)用早有報道。在氨基酸和肽類衍生物等生物藥物成分的分離純化方面也有應(yīng)用, 并且采用pH- 區(qū)帶精制逆流色譜等新型分離純化技術(shù)可以使酸性或堿性的這類物質(zhì)達到10g量級的制備。但是采用HSCCC對蛋白質(zhì)等生物大分子藥物的分離制備還存在一些問題。主要是目前商業(yè)化的HSCCC儀器對于分離小分子藥物所需要的含有機相兩相溶劑體系有較高的固定相保留, 而對于分離生物大分子所需要的聚合物雙水相體系的保留能力較差, 而固定相的保留值是關(guān)系到分離效率高低的重要參數(shù)之一。因此, 研究和開發(fā)高效的分離生物大分子的HSCCC儀器和方法是近年來人們研究關(guān)注的又一個熱點問題，是制約HSCCC在藥物研發(fā)中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵問題。首先, HSCCC 是一種相對較新的分離純化技術(shù),盡管它具有許多與生俱來的優(yōu)點，但是人們對它的認識和理解還需要一個逐步深入的過程, 因而從某種程度上影響了它的應(yīng)用; 其次, HSCCC 技術(shù)的廣泛應(yīng)用還需要有更為成熟穩(wěn)定的儀器設(shè)備條件的支撐。目前國內(nèi)只有一二家專門從事逆流色譜儀器研發(fā)和生產(chǎn)的機構(gòu), 主要生產(chǎn)可用于實驗室半制備分離的儀器。另外國家對該項技術(shù)研發(fā)的投入和支持也很有限, 缺乏對該項技術(shù)和相關(guān)設(shè)備的系統(tǒng)性的研究, 目前國內(nèi)可用于大規(guī)模生產(chǎn)的商業(yè)化儀器設(shè)備研制和開發(fā)還處于起步階段。國外已有工業(yè)化儀器設(shè)備面世, 但由于技術(shù)保密等方面的顧慮, 目前還沒有投放國內(nèi)市場, 且價格昂貴。因此, HSCCC 的工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用還需要國家和有關(guān)行業(yè)的投入