褐化、白化、玻璃化、黃化的現(xiàn)象的解釋.docx

精品文檔do:i 10. 3969 / j. issn. 1673- 2006. 2010. 11. 019植物組織培養(yǎng)中的常見問題與對策王桂榮(宿州職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 安徽宿州市 234000)摘要: 探討了影響植物組織培養(yǎng)的主要因素, 分析了污染、畸形胚、玻璃苗、褐變、黃化等產(chǎn)生的原因, 并提出了解決措施。認為: 污染主要是由滅菌不徹底和環(huán)境不潔造成的, 加強外植體和培養(yǎng)基的滅菌, 對培養(yǎng)環(huán)境及用具徹底消毒, 可大大降低污染率。培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基的組成影響畸形胚的發(fā)生, 縮短培養(yǎng)時間, 調(diào)整培養(yǎng)基中激素含量, 可使畸形胚轉(zhuǎn)化為正常苗。培養(yǎng)基的種類、溫度、通氣狀況等會影響玻璃苗的發(fā)生, 選擇適當(dāng)培養(yǎng)基, 降低溫度, 增強光照, 改善通風(fēng)等可使玻璃化率降低。植物品種、取材部位及環(huán)境條件與褐變的發(fā)生密切相關(guān), 選擇適宜的外植體, 進行暗處理, 添加抗氧化劑和吸附劑等可有效控制褐變。培養(yǎng)基中鐵含量不足, 激素配比不當(dāng)?shù)葧?dǎo)致黃化,正確添加培養(yǎng)基的各種成分, 增強光照, 及時轉(zhuǎn)接可減少黃化。關(guān)鍵詞: 組織培養(yǎng); 污染; 褐化; 畸形胚; 玻璃苗中圖分類號: Q945. 4 文獻標(biāo)識碼: A 文章編號: 1673- 2006( 2010) 11- 0054- 04收稿日期: 2010- 04- 10作者簡介: 王桂榮( 1972- ), 女, 安徽宿州人, 實驗師, 主要從事植物及植物生理實踐教學(xué)與實驗室管理。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物脫毒快繁、育種、種質(zhì)保存、獲得次生代謝產(chǎn)物、突變誘發(fā)、細胞工程和基因工程等方面, 而且在醫(yī)藥、食品工業(yè)、能源工業(yè)、環(huán)境保護各個領(lǐng)域顯示出極大的生產(chǎn)潛力,產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益, 已成為當(dāng)代生物科學(xué)中最有生命力的一門學(xué)科。但在植物初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過程中經(jīng)常會遇到一些問題, 如污染、畸形胚、玻璃苗、褐變、黃化等, 影響實驗結(jié)果, 甚至導(dǎo)致實驗失敗, 給科研和生產(chǎn)造成損失。本文根據(jù)近年的研究文獻及本人的工作實踐, 對這幾個問題產(chǎn)生的原因及解決措施進行了論述, 以供參考。1. 1 污染產(chǎn)生的原因污染是在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌, 導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。造成污染的原因有多種, 培養(yǎng)環(huán)境不清潔, 母株預(yù)處理不當(dāng), 外植體滅菌不凈,培養(yǎng)基受菌污染, 實驗所用儀器消毒不徹底, 操作程序不當(dāng)?shù)榷紩斐晌廴?。細菌污染的主要特征是培養(yǎng)材料周圍出現(xiàn)粘液菌斑或培養(yǎng)基中出現(xiàn)混濁霧狀痕跡, 主要由外植體、操作器具、培養(yǎng)基滅菌不嚴(yán)引起。真菌污染的特征是菌斑呈絨毛狀、絮狀, 有不同顏色的孢子, 多由如操作不慎真菌孢子從瓶口落入造成污染。另外還有內(nèi)生菌造成的潛伏性污染 1 。1. 2 防止污染的對策1. 2. 1 嚴(yán)格消毒, 規(guī)范操作程序接種室、超凈工作臺、培養(yǎng)室要定期消毒, 培養(yǎng)室相對濕度控制在70% 左右。室內(nèi)污染源主要是空氣中的真菌和細菌, 可用75% 的酒精室內(nèi)噴霧,也可用高錳酸鉀和甲醛混合熏蒸。接種前用70%的酒精擦洗超凈工作臺, 并且打開紫外線燈照射30分鐘, 保證超凈工作臺處于無菌狀態(tài)。嚴(yán)格無菌操作, 接種工具全部消毒, 接種人員自身要全面消毒等。每次操作都要用酒精燈燒烤接種針, 在操作過程中, 盡量不說話, 頭部不要伸入操作臺內(nèi), 快速完成接種過程。1. 2. 2 外植體和培養(yǎng)基的滅菌在組織培養(yǎng)過程中, 選擇不易污染且易表達全能性的外植體是成功建立組織培養(yǎng)體系的決定因素之一, 所取外植體材料為較幼嫩的莖、葉時, 可先將材料用清水沖洗干凈, 用吸水紙吸干, 再以70% 的酒精浸泡, 無菌水沖洗后, 用2% 10% 的次氯酸鈉浸泡。如李慧等在草莓莖尖組織培養(yǎng)中比較了5種不同滅菌方法: 漂白粉飽和上清液浸泡材料15 30分鐘, 10% 次氯酸鈉浸泡10 15分鐘, 10% 12%過氧化氫浸泡10 20分鐘, 5% 10% 新潔爾滅溶液浸泡10 15分鐘, 0. 1% 的升汞浸泡8 10分鐘。實驗結(jié)果表明, 前4種滅菌劑安全性較高, 但滅菌時間長, 往往會使接種材料的表面氧化褐變; 升汞殺菌效果較好, 但浸泡時間長會造成材料中毒。因此, 根據(jù)外植體材料的不同把握好不同滅菌劑的滅菌時間和使用濃度至關(guān)重要。外植體切割時, 把消毒后的外植體分成3份放在不同的無菌培養(yǎng)器皿中防止交叉污染。以莖尖作為外植體時, 在無菌條件下對枝條進行暗培養(yǎng), 待抽出黃色的新芽時, 再采下芽作為外植體, 可明顯減少污染。外植體經(jīng)流水沖洗后, 在2 4 的低溫下處理1 天左右, 可用0. 3% 0.6% 次氯酸鈉或0. 1% 升汞消毒。接種于只含蔗糖的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周, 使組織培養(yǎng)中的酚類物質(zhì)滲入培養(yǎng)基中, 取出外植體用0. 1% 漂白粉溶液浸泡10分鐘, 轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng), 可大大降低污染率。對于難消毒的材料如種子, 可用0.2% 的升汞消毒3 5分鐘或用5% 10% 的次氯酸鈉浸泡25 30分鐘。趙永輝 2 等對結(jié)縷種子, 先用70%酒精浸泡, 再用5% 次氯酸鈉浸泡20分鐘, 消毒效果較好。對于有茸毛、表面粗糙不平的材料可先用70% 的酒精浸泡, 或在消毒劑中加幾滴表面活性劑吐溫80, 吐溫80促使滅菌液充分接觸材料表面, 以達到充分消毒的目的 3 。針對潛伏性污染,外植體經(jīng)過消毒后, 放在不含激素和維生素的培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)一段時間后取出再消毒。對內(nèi)源細菌污染嚴(yán)重的外植體, 可在培養(yǎng)基中加入0. 3% 的丙酸鈉等殺菌劑有較好的效果。李穎 4 等的研究證明,繼代培養(yǎng)中只有真菌污染, 采用3% 的多菌靈浸泡30分鐘可滅菌。任敬民等在臺灣青棗的組織培養(yǎng)中, 先用600倍的多菌靈噴灑, 經(jīng)30秒75% 酒精消毒后, 再用0. 1% 升汞加幾滴吐溫80 消毒5分鐘,既能減少污染又能促進外植體愈傷組織生長 5 。對培養(yǎng)基采用微波間隙滅菌法, 微波滅菌具有成本低、效率高、處理后無污染等特點。減少培養(yǎng)基中的有機成分或在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)那嗝顾?、鏈霉素等抗生? 可防止污染。2 畸形胚2. 1 出現(xiàn)畸形胚的原因體細胞胚胎在早期發(fā)育時出現(xiàn)畸形, 形態(tài)和生理功能都出現(xiàn)異常, 不能育成苗, 或移栽不能成活的現(xiàn)象叫畸形胚, 如聯(lián)體胚、子葉畸形胚、單極胚、多極胚、無極胚、胚軸畸形胚、重新愈傷化胚、玻璃化胚、白化胚等 6 。越靠近子葉片, 畸形胚分化率越高,子葉片上的不定胚幾乎都是畸形胚。鄭泗軍等 7認為染色體變異是導(dǎo)致畸形胚形成的原因之一。李克勤等 8 在實驗中研究發(fā)現(xiàn), 不同陸地棉品種產(chǎn)生畸形胚的頻率不同, IAA、GA3含量較高的培養(yǎng)基和高溫高濕的環(huán)境條件是畸形胚產(chǎn)生的原因。張寶紅等 6 研究發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的延長, 畸形胚的發(fā)生量增加。在MS+ 0. 2 mg /L IAA+ 0. 1mg /L 2, 4- D+ 0. 1 mg /L KT培養(yǎng)基上, 短期培養(yǎng)的愈傷組織形成的體細胞胚中畸形胚的發(fā)生率為34. 4% , 而長期培養(yǎng)的愈傷組織形成的體細胞胚中畸形胚的發(fā)生率為93. 1%。2. 2 防控對策在體胚發(fā)育早期, 培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的ABA、NAA、KT, 子葉畸形胚、多極胚和其他畸形較輕的胚狀體可在畸形胚的基礎(chǔ)上長出正常芽, 逐漸發(fā)育成正常苗。當(dāng)KT 使用濃度為0. 5mg /L時, 最有利于畸形胚萌發(fā)轉(zhuǎn)化為正常苗, 轉(zhuǎn)化率可達37.5% 8 。增加蔗糖濃度或直接干燥減少水分, 縮短胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)時間, 減少種植密度, 選擇通風(fēng)透光條件好的培養(yǎng)器, 都可減少畸形胚的發(fā)生。3 玻璃苗3. 1 玻璃苗的發(fā)生植物組織培養(yǎng)中, 出現(xiàn)試管苗含水量高, 嫩梢呈半透明狀, 葉片皺縮卷曲, 植株矮小失綠, 葉表無角質(zhì)層臘質(zhì), 組織結(jié)構(gòu)發(fā)育畸形的現(xiàn)象, 這時的試管苗稱為玻璃苗。玻璃苗生根困難, 移栽后不易成活, 不能繼續(xù)培養(yǎng)。玻璃苗多為組培過程中措施不當(dāng)造成的非遺傳生理性失調(diào)癥狀, 進行適當(dāng)?shù)幕謴?fù)培養(yǎng), 多數(shù)可恢復(fù)正常生長。培養(yǎng)基中離子種類, 比例不適,瓊脂濃度低, 培養(yǎng)環(huán)境如溫度、光照、濕度、pH 值、通氣不良等間接影響玻璃苗的發(fā)生。周菊華等 9 發(fā)現(xiàn)瑞香外植體取材部位不同, 玻璃苗發(fā)生頻率亦不同, 芽與莖基之間的中段莖易發(fā)生玻璃化。李云 10等在珠美海棠試管苗培養(yǎng)中, 發(fā)現(xiàn)玻璃苗的產(chǎn)生是光呼吸途徑和磷酸戊糖途徑被抑制的結(jié)果。3. 2 防控對策選擇不易玻璃化的基因型材料及部位作為外植體; 選擇適當(dāng)培養(yǎng)基、糖源及外源激素的種類和濃度, 提高培養(yǎng)基中C a2 + Zn2 + 等離子濃度, 適當(dāng)提高瓊脂用量; 降低培養(yǎng)基的襯質(zhì)勢, 減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分; 適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖含量, 降低培養(yǎng)器內(nèi)部環(huán)境的相對溫度; 改善培養(yǎng)容器的通風(fēng)換氣條件, 使用透氣性好的容器或封口材料如用棉塞封口等都可減少玻璃苗的發(fā)生。周菊華等 9發(fā)現(xiàn), 降低培養(yǎng)溫度和相對濕度或用40 熱擊處理, 培養(yǎng)基中增加Fe、P、K、Cu、Mn、Zn等元素, 降低B含量, 可有效防止玻璃苗的發(fā)生。黃榮韶等在無籽西瓜離體培養(yǎng)中, 于培養(yǎng)基中添加青霉素60 mg /L和氯化膽堿, 有效減少玻璃苗的發(fā)生。晝夜變溫,采用強光照, 增加光強可促進光合作用, 有利于玻璃苗的恢復(fù)。李竹梅等 11 研究發(fā)現(xiàn)采用白熾燈光源,光照強度在2000 4000 Lx, 光照時間在12 14小時, 溫度25 左右, 提高培養(yǎng)基中糖和瓊脂的濃度,55添加適當(dāng)?shù)拟}離子, 6 - BA 含量小于6 mg /L, IAA0. 5mg /L, 可有效降低西瓜試管苗玻璃化的發(fā)生頻率。饒雪琴等 12 發(fā)現(xiàn)玻璃化苗隨培養(yǎng)代數(shù)的增加而增加, 用去離子水配制分化培養(yǎng)基, 并添加0. 3%的活性炭, 玻璃化率大大降低。4 褐變4. 1 褐變發(fā)生的原因影響褐變因素有很多, 因植物品種、基因型、外植體的取材部位及生理狀態(tài)、材料的年齡和大小、光照、溫度等環(huán)境條件的影響, 褐變程度差異較大。單寧、色素含量高的木本植物易發(fā)生褐變, 像板栗、核桃因單寧含量高, 在初代、繼代培養(yǎng)中極易發(fā)生褐變而死亡。像塊莖鱗莖類、天南星科、松柏科、木蘭科、茶科植物很易褐化。薔薇科、金縷科, 木犀科植物等不易褐化。幼齡材料褐變率較低, 冬春季節(jié)褐變較輕, 而夏季褐變較重。溫度過高或光照較強會促進酚類物質(zhì)的氧化, 加速褐變。有些植物如菊的莖段雖然易褐化, 但并不影響愈傷組織或叢生芽的誘導(dǎo), 可不考慮褐化因素。當(dāng)褐化嚴(yán)重影響了愈傷組織和芽的誘導(dǎo)時, 就要采取措施抑制褐變。4. 2 控制褐變的對策選用適宜的外植體、控制培養(yǎng)條件以及選擇幼齡材料作為外植體, 褐變較輕。外植體受傷害程度直接影響褐變, 切割時盡可能減小傷口面積, 并縮短切口暴露在空氣中的時間。筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)切口長度以8 14 mm 褐變較輕, 成活率達85% 。選擇合適的消毒劑和消毒方法, 增加瓊脂的用量使培養(yǎng)基的硬度增大, 降低了酚類物質(zhì)的擴散速度, 褐變減少。初期培養(yǎng)要在黑暗和弱光下進行。降低溫度,暗處理母株, 連續(xù)轉(zhuǎn)移幾次, 可減少外植體發(fā)生褐變。陳菲等 13 試驗得出重度遮光處理褐變率為58. 2%, 自然光照為88. 3% , 輕度遮光處理褐變率為79. 6% , 表明對母株預(yù)先遮光處理可減輕褐變。毛紅俊等 14 在香水白掌離體培養(yǎng)實驗結(jié)果表明, 葉片在1 /2MS培養(yǎng)基中添加PVP 1 000 mg /L, 5天繼代轉(zhuǎn)接1次, 抗褐變效果較好; 葉柄在PVP為1 000mg /L, 瓊脂濃度為7 g /L的培養(yǎng)基中, 5天繼代轉(zhuǎn)接1次, 可減少褐變的發(fā)生。周艷等 15 試驗表明馬纓杜鵑暗培養(yǎng)的最佳時間為10天, 可使褐變發(fā)生推遲并減少。在暗培條件下, 培養(yǎng)基中添加1 g /L AC與連續(xù)轉(zhuǎn)接措施結(jié)合, 褐變率可降到15. 03% 。適當(dāng)降低培養(yǎng)基的無機鹽濃度, 酸性環(huán)境( pH 值4. 5 5. 0) 不利于褐變的發(fā)生。在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑和吸附劑, 趙瑋 16 發(fā)現(xiàn)控制茶樹組培褐化的最佳培養(yǎng)基配方是0. 5 倍標(biāo)準(zhǔn)鐵鹽濃度的MS + N a2S2O3 0. 50 g /L+ AC 0. 50 g /L, 褐化率為40. 5%。王照紅等 17 研究發(fā)現(xiàn)加入賴氨酸、活性炭、抗壞血酸的培養(yǎng)基, 25天時有80%出現(xiàn)褐變并伴有死亡現(xiàn)象, 而加入0. 7g / L聚乙烯吡咯烷酮( PVP K - 90)的培養(yǎng)基褐變率為16% , 對抑制桑樹組培苗的褐變有良好效果。馬文卿等 18 在大花惠蘭試管苗培養(yǎng)中研究發(fā)現(xiàn), 培養(yǎng)基中添加1 500 mg /L 活性碳, 抑制褐變效果好。筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)將蘋果枝條在低溫5 下處理2天, 核桃外植體在5 下處理1天可減輕褐變。5 黃化5. 1 培養(yǎng)苗出現(xiàn)黃化現(xiàn)象的原因培養(yǎng)基中礦物質(zhì)營養(yǎng)不均衡、鐵含量不足、激素配比不當(dāng)、糖不足、長期不轉(zhuǎn)移、培養(yǎng)環(huán)境通氣不良、pH 值大、光照不足、培養(yǎng)溫度不適等, 是整株失綠、全部或部分葉片黃化的主要原因。5. 2 采取對策正確添加培養(yǎng)基的各種成分, 降低培養(yǎng)溫度, 增加光照, 及時轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物, 適當(dāng)調(diào)節(jié)pH 值, 使用透氣的封口膜增加透氣性, 減少抗生素類物質(zhì)的使用。在分化階段進行適當(dāng)壯苗。6 結(jié)束語 在組培過程中, 污染率較高, 目前采取的措施就是在培養(yǎng)基中加入抗生素或用抑菌劑處理。但抗生素和抑菌劑遇酸堿、加熱等易分解而失去活性, 并且工作量大, 成本也高。所以加強組培過程中常見的雜菌防治技術(shù)研究很重要, 進一步研究和開發(fā)價格較低、性能穩(wěn)定、殺菌效果好的抑菌劑非常必要。調(diào)節(jié)激素可使部分畸形胚轉(zhuǎn)化為正常苗, 導(dǎo)致畸形胚產(chǎn)生的其他因素如培養(yǎng)條件的影響, 培養(yǎng)基中的激素效應(yīng)還有待于更深入的研究。引起外植體褐變的因素除了外植體自身的原因如基因型、生理、營養(yǎng)狀況、取材部位等, 另一方面就是外植體的培養(yǎng)環(huán)境。