生物電化學(xué)傳感器研究.doc

生物電化學(xué)傳感器研究摘要：生物電化學(xué)傳感器是生物傳感器中研究最早、種類最多的一個(gè)分支, 它具有專一、高效、簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn), 已應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)及工業(yè)分析等方面。其工作原理是以固定化的生物成分(如酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原)或生物體本身(如細(xì)胞、微生物、組織等)為敏感材料，與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)換能器相結(jié)合，用于快速檢測(cè)物理、化學(xué)、生物量的新型器件。根據(jù)作為敏感元件所用生物材料的不同,電化學(xué)生物傳感器分為酶電極傳感器、微生物電極傳感器、電化學(xué)免疫傳感器、組織電極與細(xì)胞器電極傳感器、電化學(xué)DNA傳感器等。關(guān)鍵詞：生物電化學(xué)傳感器（bioelectrochemical sensor），敏感材料（sensetive material），識(shí)別系統(tǒng)（recognition system）1.生物化學(xué)傳感器基本工作原理傳感器通常由敏感(識(shí)別)元件、轉(zhuǎn)換元件、電子線路及相應(yīng)結(jié)構(gòu)附件組成。生物傳感器是指用固定化的生物體成分(酶、抗原、抗體、激素等)或生物體本身(細(xì)胞、細(xì)胞器、組織等)作為感元件的傳感器。電化學(xué)生物傳感器則是指由生物材料作為敏感元件,電極(固體電極、離子選擇性電極、氣敏電極等)作為轉(zhuǎn)換元件,以電勢(shì)或電流為特征檢測(cè)信號(hào)的傳感器。由于使用生物材料作為傳感器的敏感元件,所以電化學(xué)生物傳感器具有高度選擇性,是快速、直接獲取復(fù)雜體系組成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技術(shù)、食品工業(yè)、臨床檢測(cè)、醫(yī)藥工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境分析等領(lǐng)域獲得實(shí)際應(yīng)用。1 敏感材料是對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行選擇性作用的生物活性單元。最先被使用的是具有高度選擇催化活性的酶。酶或是以物理方法(包埋、吸附等)，或是以化學(xué)方法(交聯(lián)、聚合等)被固定在化學(xué)傳感器的敏感膜中，然后，以化學(xué)電極作為換能器測(cè)定酶催化目標(biāo)物反應(yīng)所生成的特定產(chǎn)物的濃度，從而問接地測(cè)定目標(biāo)物的濃度。隨著物理檢測(cè)手段的引入，人們已成功地把抗體、DNA聚合物、核酸、細(xì)胞受體和完整細(xì)胞等具有特異選擇性作用功能的生物活性單元用作了敏感材料。2 2.生物化學(xué)傳感器的發(fā)展歷史與現(xiàn)狀3 1962年，Clark在紐約自然科學(xué)學(xué)會(huì)的論文集中首次提出了“在化學(xué)電極的敏感膜中加入酶以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行選擇性分析”的設(shè)想。1967年，Updike等人把葡萄糖氧化酶固定化膜和氧電極組裝在一起，制成了第一代生物傳感器。經(jīng)過40年地不斷發(fā)展，隨著研究的深入，各種物理手段不斷地被引入到生物傳感器，當(dāng)今的生物傳感技術(shù)日新月異。1975年，熱酶探針(thermal enzyme probe)和酶熱敏電阻器(tnzyme thermistor)分別研制成功。20世紀(jì)70年代起，人們就開始尋求一種可以直接捕捉敏感源與目標(biāo)物之間結(jié)合過程(如，抗體與抗原的結(jié)合)的換能器。直到1983年，Leiberg等人發(fā)表了一篇采用表面等離子體共振(SPR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)親合反應(yīng)的報(bào)道后，這一問題才得到解決，這一技術(shù)隨即促成了免疫傳感器的產(chǎn)生。1984年，Turner等人報(bào)道了用二茂鐵及其衍生物作為氧化還原酶的介體以制造廉價(jià)酶電極的方法。很快MediSense公司便以此為基礎(chǔ)發(fā)展了能大規(guī)模生產(chǎn)具有高重現(xiàn)性酶電極的絲網(wǎng)印刷技術(shù)，該技術(shù)推動(dòng)了生物傳感器的發(fā)展。20世紀(jì)90年代初，生物傳感器的研究進(jìn)入第二階段，這時(shí)期的生物傳感器為第二代。第二代生物傳感器的特點(diǎn)是使用抗體或受體蛋白作分子識(shí)別組件，換能器的選用則更為多樣化，諸如場(chǎng)效應(yīng)管(FET)，光纖(FOS)，壓電晶體(PZ)，聲表面波(SAW)器件等。1996年，Turner等人研制的一種以DNA為敏感源的傳感器，利用液晶分散技術(shù)，將DNA聚陽(yáng)離子配合物固定在換能器上，所有能影響DNA分子間交聯(lián)度的化學(xué)和物理因素均能被靈敏地捕獲，并反映為一個(gè)強(qiáng)的、具有“指紋”結(jié)構(gòu)的圓二色譜吸收峰。2l世紀(jì)發(fā)展的生物傳感器為第三代產(chǎn)品，隨著微加工技術(shù)和納米技術(shù)的進(jìn)步，生物傳感器不斷地向微型化、集成化方向發(fā)展，便攜式測(cè)試儀已得到快速發(fā)展。當(dāng)今，納米材料在生物傳感器中的應(yīng)用，使其研究進(jìn)入嶄新階段。我國(guó)生物傳感器研究始于20世紀(jì)80年代初，20世紀(jì)90年代是我國(guó)生物傳感器應(yīng)用取得較大發(fā)展的l0年，山東省科學(xué)院生物研究所是國(guó)內(nèi)首家在該方面研究開發(fā)取得成功的單位，從1983年到1998年已研制成功了l0多項(xiàng)產(chǎn)品，有的成果達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。以SBA_40型和50型生物傳感分析儀為代表，儀器集成了許多智能化操作程序，其主程序可方便地滿足多種自動(dòng)測(cè)定要求。具有多酶協(xié)同作用的復(fù)合酶膜生物傳感器，通過自動(dòng)測(cè)定程序?qū)崿F(xiàn)了糖化酶活性的快速自動(dòng)測(cè)量，應(yīng)用雙電極一差分的方法實(shí)現(xiàn)了難以分析的生化樣品測(cè)定，包括尿素、谷氨酰胺、淀粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖等。4 3. 生物化學(xué)傳感器的應(yīng)用研究生物化學(xué)傳感器的分類方法很多，通常按照感受器中所采用的生命物質(zhì)分類，可分為分為酶電極傳感器、微生物電極傳感器、電化學(xué)免疫傳感器、植物組織電極傳感器、電化學(xué)DNA傳感器等。3.1酶電極傳感器 酶?jìng)鞲衅魇巧飩鞲衅黝I(lǐng)域中研究最多的一種類型。生物傳感器中的生物活性物質(zhì)是傳感器的核心部分,然而它們一般都溶于水,其本身也不穩(wěn)定,需要固定在各種載體上,才可延長(zhǎng)生物活性物質(zhì)的活性。固定化技術(shù)的運(yùn)用很大程度上決定著傳感器的性能,包括選擇性、靈敏度、穩(wěn)定性、檢測(cè)范圍與使用壽命等。隨著廣大科技工作者的不斷努力,我國(guó)酶?jìng)鞲衅鞯难芯咳〉昧撕艽蟮倪M(jìn)步,主要表現(xiàn)在防止電子媒介體和酶的流失、提高固定化酶活力的技術(shù)、載體選擇范圍擴(kuò)大和各種高新技術(shù)在酶?jìng)鞲衅髦械膽?yīng)用等方面。以葡萄糖氧化酶(GOD)電極為例簡(jiǎn)述其工作原理。在GOD的催化下,葡萄糖(C6H12O6)被氧氧化生成葡萄糖酸(C6H12O7)和過氧化氫。根據(jù)上述反應(yīng),顯然可通過氧電極(測(cè)氧的消耗)、過氧化氫電極(測(cè)H2O2的產(chǎn)生)和pH電極(測(cè)酸度變化)來(lái)間接測(cè)定葡萄糖的含量。因此只要將GOD固定在上述電極表面即可構(gòu)成測(cè)葡萄糖的GOD傳感器。這便是所謂的第一代酶電極傳感器。這種傳感器由于是間接測(cè)定法,故干擾因素較多。第二代酶電極傳感器是采用氧化還原電子媒介體在酶的氧化還原活性中心與電極之間傳遞電子。第二代酶電極傳感器可不受測(cè)定體系的限制,測(cè)量濃度線性范圍較寬,干擾少?，F(xiàn)在不少研究者又在努力發(fā)展第三代酶電極傳感器,即酶的氧化還原活性中心直接和電極表面交換電子的酶電極傳感器。目前已有的商品酶電極傳感器包括:GOD電極傳感器、L 乳酸單氧化酶電極傳感器、尿酸酶電極傳感器等。在研究中的酶電極傳感器則非常多。 3.1.1電化學(xué)酶?jìng)鞲衅骰陔娮用浇轶w的葡萄糖傳感器,具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性好、壽命長(zhǎng)、抗干擾性能好等優(yōu)點(diǎn),尤為受到重視。二茂鐵由于有不溶于水、氧化還原可逆性好、電子傳遞速率高等優(yōu)點(diǎn),得到了廣泛的研究和應(yīng)用。目前研究的重點(diǎn)是防止二茂鐵等電子媒介體的流失,從而提高生物傳感器的穩(wěn)定性和壽命。提高傳感器穩(wěn)定性的主要方法是利用環(huán)糊精作為載體,形成主客體結(jié)構(gòu)。如孫康等5 以- 環(huán)糊精與戊二醛縮合而成的聚合物(- CDP)為主體,電子媒介體二茂鐵為客體,形成穩(wěn)定的包絡(luò)物,制成了葡萄糖、乳糖生物傳感器。由于包絡(luò)物的形成,避免了二茂鐵的流失,生物傳感器的穩(wěn)定性得到提高,使用壽命得到延長(zhǎng)。再如朱邦尚等6 以電子媒介體1 ,1 - 二甲基二茂鐵為客體與- CDP 形成穩(wěn)定的主客體包絡(luò)物。用牛血清白蛋白- 戊二醛交聯(lián)法,把葡萄糖氧化酶(GOD) 和主客體包絡(luò)物固定到電極上,成功地制成了葡萄糖傳感器。該傳感器具有穩(wěn)定性高、選擇性好和較長(zhǎng)的使用壽命等優(yōu)點(diǎn),線性響應(yīng)范圍為0. 0118 mmol/ L 。利用二茂鐵也可以制成組織傳感器。3.1.2光化學(xué)酶?jìng)鞲衅魉握A7 等將具有分子識(shí)別功能的- 葡萄糖甙酶和能進(jìn)行換能反應(yīng)的Luminol 分別固定在殼質(zhì)胺和大孔陰離子交換劑的柱中,組成流動(dòng)注射系統(tǒng)?？嘈尤蔬霸? 葡萄糖甙酶催化下分解生成的CN-(分子識(shí)別反應(yīng)) 與溶解氧反應(yīng)生成超氧陰離子自由基,繼而同Luminol 反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(換能反應(yīng)) 。這一新型生物傳感器的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與苦杏仁甙量在1200g 之間呈良好線性關(guān)系,檢出限為0. 3g ,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3. 1 % ,并具有良好選擇性。每次測(cè)定時(shí)間為2min ,- 葡萄糖甙酶柱壽命為6 個(gè)月,Luminol 柱可使用200 次以上。3.1.3酶?jìng)鞲衅髦袘?yīng)用的新技術(shù)3.1.3.1 納米技術(shù)固定化酶時(shí)引入納米顆粒能夠增加酶的催化活性,提高電極的響應(yīng)電流值。首先,納米顆粒增強(qiáng)GOD 在載體表面上的固定作用;其次是定向作用,分子在定向之后,其功能會(huì)有所改善;第三,由于金、鉑納米顆粒具有良好的導(dǎo)電性和宏觀隧道效應(yīng),可以作為固定化酶之間、固定化酶與電極之間有效的電子媒介體,從而使得GOD 的氧化還原中心與鉑電極間通過金屬顆粒進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移成為可能,酶與電極間可以近似看作是一種導(dǎo)線來(lái)聯(lián)系的。這樣就有效地提高了傳感器的電流響應(yīng)靈敏度。3.1.3.2基因重組技術(shù)周亞鳳等8 將黑曲霉GOD 基因重組進(jìn)大腸桿菌、酵母穿梭質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化甲基營(yíng)養(yǎng)酵母,構(gòu)建出GOD 的高產(chǎn)酵母工程菌株。重組酵母GOD 比活力達(dá)426. 63 u/ mg 蛋白,是商品黑曲霉GOD 的1.6 倍,催化效率更高。重組酵母GOD 的高活力特性可有效提高葡萄糖傳感器的線性檢測(cè)范圍。3.1.3.3 溶膠- 凝膠技術(shù)溶膠- 凝膠應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域具有如下一些優(yōu)點(diǎn)9 : (1) 基質(zhì)在可見光區(qū)是透明的,適于光化學(xué)生物傳感器的制作; (2) 基質(zhì)具有一定的剛性,提高了生物活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性; (3) 基質(zhì)熱穩(wěn)定性好,并且呈化學(xué)惰性,對(duì)生物活性物質(zhì)的失活作用很小,保持了活性; (4) 通過溶膠-凝膠制備條件的優(yōu)化,可控制基質(zhì)的孔徑大小和分布,使酶分子有足夠的自由活動(dòng)空間而又不至于從基質(zhì)中流失,從而提高傳感器的使用壽命;(5) 溶膠- 凝膠材料還具有生物相容性,為微電極植入人體提供了新的可能性; (6) 還可通過對(duì)先驅(qū)體的功能化賦予溶膠- 凝膠新的性能; (7)溶膠- 凝膠的制備條件十分溫和,生物分子可以在不同的制備階段加入,并且可以制成不同大小與形狀的修飾電極等。溶膠- 凝膠材料作為酶固定化載體,開辟了制備生物傳感器的新領(lǐng)域。3.1.3.4酶的定向取向技術(shù)經(jīng)典的固定化酶方法主要有物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)、交聯(lián)、凝膠包埋和微膠囊法等。酶在固定化過程中活力降低的因素主要有: (1) 固定過程中的化學(xué)損傷; (2) 酶分子不適合的空間取向使得與底物發(fā)生鄰近定向效應(yīng)受阻,催化作用減弱。因此,酶或蛋白質(zhì)分子空間沉積的方向控制是制備高質(zhì)量固定化酶、酶標(biāo)試劑和生物器件的前提。固定化酶空間取向方法主要有共價(jià)鍵法、氨基酸置換法、抗體偶聯(lián)法、生物素- 親和素親和法和疏水定向固定法等。應(yīng)用較多的是生物素- 親和素親和法。生物素- 親和素之間具有高度專一和強(qiáng)烈的相互作用,在pH 值、溫度、有機(jī)溶劑或變性劑等較大的變化范圍內(nèi)均能穩(wěn)定存在,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的固定化及生物傳感器。3.2 微生物電極傳感器由于離析酶的價(jià)格昂貴且穩(wěn)定性較差,限制了其在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用,從而使研究者想到直接利用活的微生物來(lái)作為分子識(shí)別元件的敏感材料。這種將微生物(常用的主要是細(xì)菌和酵母菌)作為敏感材料固定在電極表面構(gòu)成的電化學(xué)生物傳感器稱為微生物電極傳感器。其工作原理大致可分為三種類型:其一,利用微生物體內(nèi)含有的酶(單一酶或復(fù)合酶)系來(lái)識(shí)別分子,這種類型與酶電極類似;其二,利用微生物對(duì)有機(jī)物的同化作用,通過檢測(cè)其呼吸活性(攝氧量)的提高,即通過氧電極測(cè)量體系中氧的減少間接測(cè)定有機(jī)物的濃度;其三,通過測(cè)定電極敏感的代謝產(chǎn)物間接測(cè)定一些能被厭氧微生物所同化的有機(jī)物。3.2.1微生物傳感器的結(jié)構(gòu)微生物傳感器是使用微生物活細(xì)胞或細(xì)胞碎片作為敏感元件與電化學(xué)換能器來(lái)制備生物傳感器。10 主要由2 部分組成：第1 部分是微生物膜，此膜是由微生物與基質(zhì)（如PVA，海藻酸鈉等）以一定的方式固化形成；第2 部分是信號(hào)轉(zhuǎn)換器（如O2電極、氣敏電極或離子選擇電極等）。3.2.2微生物傳感器的工作原理及分類微生物在利用物質(zhì)進(jìn)行呼吸或代謝的過程中，將消耗溶液中的溶解氧或產(chǎn)生一些電活性物質(zhì)。在微生物數(shù)量和活性保持不變的情況下，其所消耗的溶解氧量或所產(chǎn)生的電活性物質(zhì)的量反映了被檢測(cè)物質(zhì)的量，再借助氣體敏感膜電極（如溶解氧電極、氨電極、二氧化碳電極、硫化氫電極）或離子選擇電極（如pH 玻璃電極）以及微生物燃料電池檢測(cè)溶解氧和電活性物質(zhì)的變化，就可求得待測(cè)物質(zhì)的量，這是微生物傳感器的一般原理。微生物電極的種類很多，根據(jù)微生物與底物作用原理的不同，微生物電極可分為測(cè)定呼吸活性型微生物電極、測(cè)定代謝物質(zhì)型微生物電極。根據(jù)測(cè)量信號(hào)的不同，可分為電流型微生物電極、電位型微生物電極。3.2.3 微生物傳感器的應(yīng)用領(lǐng)域1975 年Divies制成了第1 支微生物傳感器,到目前,微生物傳感器可測(cè)定物質(zhì)已達(dá)六七十種,表1 列出了一些典型微生物傳感器及其特性。微生物傳感器不僅可以測(cè)定單一成分物質(zhì),如葡萄糖等各類碳水化合物、甲酸等各類有機(jī)酸、硝酸鹽等各類含氮化合物和各類氨基酸等,還可以測(cè)定多種化合物的總量和集合效應(yīng)。在發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域,微生物傳感器已應(yīng)用于原材料、代謝產(chǎn)物的測(cè)定。應(yīng)用微生物傳感器可不受發(fā)酵過程中常存在的干擾物質(zhì)的干擾,并且不受發(fā)酵液混濁程度的限制。在生物工程領(lǐng)域,微生物傳感器已用于酶活性的測(cè)定。微生物傳感器還能用于測(cè)定微生物的呼吸活性,在微生物的簡(jiǎn)單鑒定、生物降解物的確定、微生物的保存方法的選擇等方面也有應(yīng)用。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里,著眼于致癌物質(zhì)對(duì)遺傳因子的變異誘發(fā)性,人們利用微生物傳感器對(duì)致癌物質(zhì)進(jìn)行一次性篩選。環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域是微生物傳感器應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域,其典型代表是BOD 傳感器。它可以測(cè)定水中可生物降解有機(jī)物的總量即生化需氧量。3.3電化學(xué)免疫傳感器免疫傳感器是生物化學(xué)傳感器中一大分枝。80年代以來(lái), 隨著生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,為免疫傳感器的發(fā)展提供了有力的幫助。由于抗原和抗體的特異性反應(yīng), 免疫傳感器較其它生物和化學(xué)傳感器有更高的專一性和選擇性。電化學(xué)免疫傳感器是免疫傳感器中研究最早, 種類最多, 也較為成熟的一個(gè)分枝, 它禍聯(lián)各種電分析技術(shù), 如溶出伏安法、脈沖伏安法、脈沖差分法等, 大大提高了它的靈敏度, 在短短幾十年里, 相繼開辟了種類繁多的研究和應(yīng)用領(lǐng)域, 目前正朝著更加靈敏、特效、微型和適用的方向發(fā)展。3.3.1 電化學(xué)免疫傳感器的分類電位型免疫傳感器電位型免疫傳感器興起于70年代, 集酶免疫分析的高靈敏度和離子選擇電極、氣敏電極的高選擇性于一體, 直接或者間接用于各種抗原、抗體的檢測(cè), 它具有可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、響應(yīng)時(shí)間較快等特點(diǎn)。通常離子選擇電極、氣敏電極被用來(lái)作為基底電極。常用的離子選擇電極如氟離子電極,碘離子電極,三甲基苯胺陽(yáng)離子電極等。酶作為標(biāo)記物用來(lái)催化底物的反應(yīng), 使底物釋放出離子或者氣體, 待測(cè)抗原或抗體的濃度與酶催化產(chǎn)物在基底電極上的響應(yīng)相關(guān)。電位型免疫分析過程中一般需要異相分離和二抗。因此, 尋求均相酶免疫分析, 不需要二抗來(lái)直接檢測(cè)抗原或抗體的濃度是眾多研究者的追求目標(biāo)。電容型免疫傳感器電容型免疫傳感器是建立在雙電層理論上的一種傳感技術(shù)。電容傳感器的測(cè)量原理比較簡(jiǎn)單, 電解電容器的電容值決定于平板表面介電層的厚度及介電性質(zhì)。在受體被接上后, 根據(jù)方程, 由引起的電容變化就可以得知被側(cè)物濃度與電容之間的關(guān)系, 如果采用實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)就會(huì)得到動(dòng)力學(xué)的變化過程。同其它生物傳感器一樣, 敏感膜的制備技術(shù)是電容型免疫傳感器中最為重要的環(huán)節(jié)。它要求首先在金屬電極或者半導(dǎo)體表面形成一種電絕緣層。電容型免疫傳感器的成功與否在很大程度上取決于這一電絕緣層。大部分選用的基底是金屬和半導(dǎo)體。11 安培分析免疫傳感器安培分析免疫傳感是將免疫技術(shù)和電化學(xué)檢測(cè)相結(jié)合的一種標(biāo)記性的免疫分析, 其標(biāo)記物有酶和電活性物質(zhì)兩類。常用來(lái)作為標(biāo)記的酶有堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、乳酸脫氧酶、葡萄糖氧化酶、青霉素酞化酶和尿素水解酶等。以酶作為標(biāo)記物的電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析首先將標(biāo)記酶預(yù)先交聯(lián)在抗體或抗原上, 然后采用夾心法或者競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行安培分析測(cè)定。夾心法免疫反應(yīng)的基本過程如圖所示，首先將抗體固定在傳感器的表面, 然后加人抗原, 使傳感器表面形成免疫復(fù)合物, 洗去過量的或未反應(yīng)的抗原加人酶標(biāo)抗體二抗培育, 在傳感器表面上抗原與酶標(biāo)抗體鍵 合, 洗去游離的酶標(biāo)抗體。最后在測(cè)試體系中加人底物, 鍵合在傳感器表面的酶標(biāo)對(duì)底物產(chǎn)生催化作用, 生成一種電活性的產(chǎn)物, 根據(jù)測(cè)試體系電流的變化與酶的活性成正比,而間接計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。競(jìng)爭(zhēng)法免疫反應(yīng)的基本過程如圖所示固定了抗體的傳感器放人含有待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原的培養(yǎng)液中, 培育后清洗, 在測(cè)試體系中加人底物, 再用與夾心法相同的方法測(cè)定傳感器酶的活性。鍵合在傳感器表面上的酶的活性與催化反應(yīng)的產(chǎn)物的量成正比, 與待測(cè)抗原的濃度成反比。競(jìng)爭(zhēng)法較夾心法簡(jiǎn)便、快速, 所以在電化學(xué)酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)中大都采用競(jìng)爭(zhēng)法。電活性標(biāo)記物一般有二茂鐵、硝基雌三醇、以及金屬離子等, 其原理類似于酶標(biāo)記, 首先將電活性物質(zhì)標(biāo)記于抗原或抗體上, 再通過競(jìng)爭(zhēng)法或夾心法將標(biāo)記物鍵合在傳感器上, 通過電分析技術(shù)檢測(cè)電活性標(biāo)記物。由于酶的化學(xué)放大作用, 所以在安培免疫分析中, 大多采用酶作為標(biāo)記物。在電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析中, 常采用的電分析技術(shù)有循環(huán)伏安法、安培分析法、差分脈沖法等, 其中安培分析法是較常采用的分析方法。3.3.2電化學(xué)免疫傳感器的應(yīng)用電化學(xué)免疫傳感器的例子有:診斷早期妊娠的hCG免疫傳感器;診斷原發(fā)性肝癌的甲胎蛋白(AFP或FP)免疫傳感器;測(cè)定人血清蛋白(HSA)免疫傳感器;還有IgG免疫傳感器、胰島素免疫傳感器等等。3.4植物組織電極傳感器直接采用動(dòng)植物組織薄片作為敏感元件的電化學(xué)傳感器稱組織電極傳感器,其原理是利用動(dòng)植物組織中的酶,優(yōu)點(diǎn)是酶活性及其穩(wěn)定性均比離析酶高,材料易于獲取,制備簡(jiǎn)單,使用壽命長(zhǎng)等。但在選擇性、靈敏度、響應(yīng)時(shí)間等方面還存在不足。3.4.1植物組織電極傳感器的發(fā)展自從1981年kuriyama首次成功地研制出利用南瓜組織薄片與二氧化碳電極組成測(cè)定L-谷氮酸的植物組織電極以來(lái), 選材方式按植物根、莖、葉、花、皮果實(shí)和種子等各種形式的植物組織電極相繼問世。這一領(lǐng)域的研究已愈來(lái)愈受分析化學(xué)家們的矚目。迄今為止, 已有十余種植物組織電極研制發(fā)表。這些工作基本是國(guó)外研究室進(jìn)行的, 國(guó)內(nèi)尚未見文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。3.4.2植物組織電極傳感器的特點(diǎn)植物組織電極具有其它生物電極共同的優(yōu)點(diǎn)(1)由于固定化技術(shù)的應(yīng)用, 可使生物催化材料反復(fù)使用;(2)可以直接在體液、發(fā)酵液、廢水等復(fù)雜試液中選擇性分析測(cè)試底物, 試液不需透明澄清, 不必預(yù)處理;(3)操作簡(jiǎn)單, 用樣量少, 測(cè)試時(shí)間短;(4)分析結(jié)果以電信號(hào)輸出, 易于自動(dòng)化監(jiān)測(cè)。組織電極可視為酶電極的衍生物, 其基本原理仍是酶催化反應(yīng), 但它與酶電極相比,更具一些獨(dú)特優(yōu)點(diǎn):(1)提供一種新概念, 即用存在于自然環(huán)境中的自然物質(zhì)本身探測(cè)自然,(2)省去了酶電極法的分離、固定化酶步驟, 具有制作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、使用壽命相對(duì)較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。其原因是一些酶在組織體內(nèi)是穩(wěn)定的, 一旦分離出來(lái)很易失活, 甚至有一些酶目前還根本無(wú)法分離,(3)可用于不知何種酶或催化途徑不清楚的體系, (4)自然材料時(shí)常已含諸如輔酶等物質(zhì)的協(xié)同因子或最佳條件下所必須的成份, 而生物催化機(jī)制常常是生物體中多種輔助因子的系統(tǒng)表現(xiàn)或分步聯(lián)合的結(jié)果。123.4.3 植物組織電極傳感器的不足雖然植物組織電極在近十年的歷史中取得了可喜成績(jī), 預(yù)示著廣闊的發(fā)展前景。但白于目前人們對(duì)各種組織的內(nèi)在功能實(shí)質(zhì)了解得尚不透徹, 從整體說(shuō), 此類電極的研究尚屬早期階段, 還存在以下幾方面的問題：（1）選擇性問題，由于組織切片不象經(jīng)分離純化的酶那樣, 含酶單一而選擇性好。組織體中往往是多種酶源的聚集體, 因此, 提高選擇性是開發(fā)一支新組織電極首先碰到也是較為困難的一項(xiàng)任務(wù), （2）重現(xiàn)性問題，植物組織電極需在使用過程中隨時(shí)進(jìn)行校正。組織中的酶因受生長(zhǎng)季節(jié)、生產(chǎn)場(chǎng)地、保存期限及切片用量等因素控制的影響, 每制備一支新組織電極, 需制作校正曲線, 而不考慮不同組織電極的重現(xiàn)性, （3）壽命問題，由于生物催化膜的壽命有限, 一般在幾天至幾周響應(yīng)時(shí)間問題由于組織切片膜的厚度一般需要約數(shù)十至數(shù)百微米, 加上細(xì)胞膜的屏障作用, 使底物擴(kuò)散受阻, 響應(yīng)時(shí)間一般比酶電極及其它類型傳感器長(zhǎng)一些, （4）理論問題目前人們的注意力較集中于尋找合適的酶源組織、選取組織切片部位及厚度、生物催化劑活性的保持和延長(zhǎng)、選擇合適的激活劑和抑制劑、探索測(cè)量的最佳條件等方面, 對(duì)電極響應(yīng)機(jī)理方面的研究基本屬于空白。3.5電化學(xué)DNA傳感器電化學(xué)DNA傳感器是近幾年迅速發(fā)展起來(lái)的一種全新思想的生物傳感器。其用途是檢測(cè)基因及一些能與DNA發(fā)生特殊相互作用的物質(zhì)。電化學(xué)DNA傳感器是利用單鏈DNA(ssDNA)或基因探針作為敏感元件固定在固體電極表面,加上識(shí)別雜交信息的電活性指示劑(稱為雜交指示劑)共同構(gòu)成的檢測(cè)特定基因的裝置。其工作原理是利用固定在電極表面的某一特定序列的ssDNA與溶液中的同源序列的特異識(shí)別作用(分子雜交)形成雙鏈DNA(dsDNA)(電極表面性質(zhì)改變),同時(shí)借助一能識(shí)別ssDNA和dsDNA的雜交指示劑的電流響應(yīng)信號(hào)的改變來(lái)達(dá)到檢測(cè)基因的目的。3.5.1電化學(xué)DNA傳感器工作原理電化學(xué)DNA 傳感器是由一個(gè)支持DNA 片段(探針)的電極和檢測(cè)電化學(xué)活性識(shí)別元素(electrochemical recog2nition element) 構(gòu)成1DNA 探針是單鏈DNA ( ss - DNA) 片段(或者一整條鏈) ,長(zhǎng)度從十幾個(gè)到上千個(gè)核苷酸不等,它與靶序列(targets quince) 是互補(bǔ)的,一般多采用人工合成的短的寡聚脫氧核苷酸作為DNA 探針1 通常是將ss -DNA (探針分子) 修飾到電極表面構(gòu)成DNA 修飾電極1由于ss - DNA 與其互補(bǔ)靶系列雜交具有高度的序列選擇性,使得這種ss - DNA 修飾電極呈現(xiàn)極強(qiáng)的分子識(shí)別功能1 在適當(dāng)?shù)臏囟?、PH、離子強(qiáng)度下,電極表面的DNA 探針分子能與靶序列選擇性地雜交,形成雙鏈DNA (ds -DNA) ,從而導(dǎo)致電極表面結(jié)構(gòu)的改變1 這種雜交前后的結(jié)構(gòu)差異,可以通過具有電活性的雜交指示劑來(lái)識(shí)別,從而達(dá)到了檢測(cè)靶序列(或特定基因) 的目的3.5.2 電化學(xué)DNA傳感器分類DNA 修飾電極是電化學(xué)DNA 傳感器的重要部分, 該類傳感器也多以此進(jìn)行分類。ssDNA 修飾(或固定) 到電極上的方法, 現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在自組裝膜法、吸附結(jié)合法、表面富集法共價(jià)鍵結(jié)合法、化學(xué)免疫法、組合法、生物素- 親和素反應(yīng)法和LB 膜法等。本文主要敘述以下幾種:3.5.2.1吸附結(jié)合法該方法是將碳糊電極放到含DNA探針分子的乙酸緩沖溶液中在一定電位下活化電極, 然后在控制電位下吸附富集探針分子, 最后用磷酸緩沖溶液淋洗后便可使用。其特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、靈活, 但定性不夠。3.5.2.2自組裝膜法即基于分子的自組作用, 在固體表面自然形成高度有序的單分子層膜的方法。在DNA 技術(shù)中, 一般是利用帶巰基( SH) 的化合物在金電極表面上可以形成自組裝單分子膜的特性來(lái)固核酸。其特點(diǎn)是表面結(jié)構(gòu)高度有序, 穩(wěn)定性好, 有利于雜交; 但對(duì)巰基化合物修飾的DNA 的純度要求高, 分離提純操作較煩瑣。3.5.2.3共價(jià)鍵結(jié)合法該法首先對(duì)電極進(jìn)行活化預(yù)處理, 以引入活性鍵合基團(tuán), 然后進(jìn)行表面的有機(jī)合成, 通過共價(jià)鍵合反應(yīng)把探針分子修飾到電極表面。劉盛輝等成功地利用乙基- (3 - 二甲基丙基) 碳二亞胺鹽酸鹽( EDC) 作為偶聯(lián)活化劑,將ss - DNA 共價(jià)固定到石墨電極表面133.5.2.4 組合法該法是將化學(xué)修飾劑與電極材料混合以制備組合修飾電極。Millan14 將18- 烷基胺或18- 烷基酸混入碳糊中, 得到修飾的碳糊電極。在DEC存在下, 18- 烷基胺的氨基與ssDNA 5末端的磷酸基形成磷酰氨鍵, 并將其固定在電極上。3.5.3 電化學(xué)DNA傳感器應(yīng)用3.5.3.1 用于DNA序列的測(cè)定人類的遺傳染病和某些傳染病的早期診斷基于已知非正常堿基序列的檢測(cè)。但傳統(tǒng)的特定序列分析存在著耗時(shí)、費(fèi)力、昂貴、難以自動(dòng)化等缺點(diǎn)。而有順序選擇性的電化學(xué)傳感技術(shù)能快速檢測(cè)特定序列, 且成本低廉、易于集成化和自動(dòng)化, 因而受到廣泛關(guān)注。3.5.3.2用于環(huán)境監(jiān)瀏利用電化學(xué)的傳感器可對(duì)一些污染物、致癌物進(jìn)行分子識(shí)別的研究。其研究?jī)r(jià)值在于建立一些物質(zhì)快速、靈敏的電化學(xué)檢測(cè)方法, 探討與其它分子的相互作用機(jī)理。3.5.3.3用于藥物的檢測(cè)和篩選及其抗病機(jī)理的研究許多藥物與核酸之間存在可逆作用,而且核酸是當(dāng)代新藥發(fā)展的首選目標(biāo)，電化學(xué)DNA 生物傳感器除了可用于特定基因的檢測(cè)外,還可以用于一些DNA 結(jié)合藥物的檢測(cè)以及新型藥物分子的設(shè)計(jì)。藥物結(jié)構(gòu)對(duì)響應(yīng)的影響是DNA修飾電極研究藥物與DNA相互作用的基礎(chǔ)。羅濟(jì)文15等人研究了道諾霉素(DNM) 在小牛胸腺DNA 修飾石墨粉末微電極上的電化學(xué)行為, 提出了測(cè)定微量DNM的方法, DNM濃度在1. 0 10 - 71. 0 10 - 5 mol/ L 之間, 其微分脈沖伏安(DPV) 峰電流與濃度有良好的線性關(guān)系, 檢出限為5. 0 10 - 8 mol/ L , 并以此為基礎(chǔ)提出了一種測(cè)定人尿中痕量DNM的方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度較高。4結(jié)束語(yǔ)生物電化學(xué)傳感器是極具有發(fā)展?jié)摿Φ膶W(xué)科領(lǐng)域，作為知識(shí)經(jīng)濟(jì)的新增長(zhǎng)點(diǎn)，它將促進(jìn)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)和常規(guī)生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，可為許多經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域提供不可缺少的信息。新的快速分析方法、新的生物儀器設(shè)備的來(lái)源、生物傳感器與納米技術(shù)、信息技術(shù)、微電子技術(shù)的交叉，將促使更多、更新的生物傳感器的產(chǎn)生。未來(lái)的生物傳感器將會(huì)和計(jì)算機(jī)完美緊密的結(jié)合，能夠自動(dòng)采集數(shù)據(jù)、處理數(shù)據(jù)，更科學(xué)、更準(zhǔn)確地提供結(jié)果，實(shí)現(xiàn)采樣、進(jìn)樣、最終完成檢測(cè)的自動(dòng)化系統(tǒng)。同時(shí)，芯片技術(shù)也將越來(lái)越多地進(jìn)入傳感器領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的集成化、一體化。參考文獻(xiàn)：1 侯新樸主編. 物理化學(xué). 北京. 第6版. 人民衛(wèi)生出版社，2007.2 Campanella L，Cubadda F，Sammartino M P，et a1An algal biosensor for the monitoring of water toxicity in estuarine enviraonmentsJWater Research，2001，35(1)：69763 姚贊，文盂良生物傳感器的發(fā)展與市場(chǎng)化J傳感器技術(shù)，1999，18(2)：134 FENG DerongBiosensors and their application in the Peoples Republic of China