第六章 凝膠過(guò)濾-1.ppt

第六章凝膠過(guò)濾 凝膠過(guò)濾 本章提要 凝膠的分類和性質(zhì)基本原理凝膠層析操作應(yīng)用 凝膠過(guò)濾 凝膠過(guò)濾 gelfiltration 又稱分子篩層析 molecularsievechromatography 或排阻層析 原理 凝膠具有內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部 路徑長(zhǎng) 后跑出層析柱 大分子物質(zhì)被排阻在外 路徑短 先跑出層析柱 這樣 不同大小的分子就得到了分離 凝膠過(guò)濾 第一節(jié)凝膠的分類及性質(zhì) 1 1葡聚糖凝膠 Sephadex 交聯(lián)度 交聯(lián)劑在凝膠中占的百分?jǐn)?shù) 交聯(lián)度大 孔徑小 能分離的分子量小 凝膠過(guò)濾 2 排阻極限 不能擴(kuò)散到凝膠基質(zhì)內(nèi)部中去的最小分子量 3 分級(jí)范圍 能分離的分子量范圍 4 吸水量 1g干凝膠所吸收水分的量 如 G 50的吸收量為5 0g 凝膠過(guò)濾 5 凝膠顆粒 用篩目表示 100 200目6 穩(wěn)定性 化學(xué)穩(wěn)定性高 凝膠過(guò)濾 1 2瓊脂糖凝膠 Sepharose 美國(guó)稱 Bio gelA英國(guó)稱 Segavac 凝膠過(guò)濾 型號(hào) 按瓊脂糖的濃度 分為 Sepharose2B 2 Sepharose4B 4 Sepharose6B 6 凝膠過(guò)濾 CL 型交聯(lián)瓊脂糖凝膠 Sepharose與1 3 二溴異丙醇在強(qiáng)堿條件下生成 pH應(yīng)用范圍更廣 pH3 14 Sepharose CL 4B 可以用作疏水層析介質(zhì)的基質(zhì) 凝膠過(guò)濾 1 3聚丙烯酰胺凝膠 單體 丙烯酰胺 Arc 交聯(lián)劑 N N 亞甲基雙丙烯酰胺 Bis 凝膠過(guò)濾 理化性質(zhì) 珠狀顆粒 用前需溶脹 穩(wěn)定性好 pH1 10的緩沖液中穩(wěn)定 凝膠過(guò)濾 1 4Sephacryl 由烯丙烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)而成 可用于分離蛋白質(zhì) 核酸 多糖 蛋白聚糖等 凝膠過(guò)濾 1 5Superdex 由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價(jià)連接而成 理化性質(zhì) 穩(wěn)定性好 pH3 12穩(wěn)定 良好的分子篩特性 凝膠過(guò)濾 第二節(jié)基本原理 凝膠過(guò)濾介質(zhì)內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 顆粒內(nèi)部有一定大小的篩孔 凝膠過(guò)濾 凝膠床總體積 Vt Vo Vi Vg Vo 凝膠顆粒外水體積 Vi 凝膠顆粒內(nèi)水體積 Vg 干膠顆粒體積 凝膠過(guò)濾 1 分配系數(shù)Kav 表征了任何一種物質(zhì)在凝膠層析中的被排阻程度 Kav Ve Vo Vt Vo Ve 洗脫體積Vt 凝膠床總體積 凝膠過(guò)濾 Kav是判斷分離效果的一個(gè)重要參數(shù) 各組分之間Kav差異越大 分離效果越好 凝膠過(guò)濾 Kav的測(cè)定 Kav Ve Vo Vt Vo Vt的計(jì)算 Vt r2h或Vt Vo Vi Vg Vo Vi Vo 外水體積 用藍(lán)色葡聚糖2000 M 200萬(wàn) 測(cè)定 Ve Vo Vi 內(nèi)水體積 用小分子物質(zhì) 硫酸銨等 測(cè)定 Ve Vo Vi 凝膠過(guò)濾 第三節(jié)凝膠層析操作 3 1凝膠的選擇和處理3 1 1凝膠的選擇1 型號(hào) 根據(jù)被分離物分子量大小來(lái)確定如 脫鹽 用SephadexG 25 凝膠過(guò)濾 2 粒度 粗 中粒度 流速快 分辨率低 細(xì)粒度 分辨率高 但流速慢 凝膠過(guò)濾 3 1 2凝膠用量的計(jì)算干膠用量 柱體積 膨脹度 再加10