實驗報告2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法.doc

實驗二 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）測定蛋白質(zhì)的分子量1 原理1.1 聚丙烯酰胺凝膠的性能及制備原理1.1.1性能聚丙烯酰胺凝膠的機械性能好，有彈性，透明，相對地化學(xué)穩(wěn)定，對pH和溫度變化比較穩(wěn)定，在很多溶劑中不溶，是非離子型的，沒有吸附和電滲作用。通過改變濃度和交聯(lián)度，可以控制孔徑在廣泛的范圍內(nèi)變動，并且制備凝膠的重復(fù)性好。由于純度高和不溶性，因此還適于少量樣品的制備，不致污染樣品。1.1.2 制備原理聚丙烯酰胺凝膠是用丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化系統(tǒng)有化學(xué)聚合和光聚合兩種。本實驗是用化學(xué)聚合?；瘜W(xué)聚合的催化劑通常多采用過硫酸銨（AP）或過硫酸鉀，此外還需要一種脂肪族叔胺作加速劑，最有效的加速劑是N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）。在叔胺的催化下，由過硫酸銨形成氧的自由基，后者又使單體形成自由基，從而引發(fā)聚合反應(yīng)。叔胺要處于自由堿基狀態(tài)下才有效，所以在低pH時，常會延長聚合時間；分子氧阻止鏈的延長，妨礙聚合作用；一些金屬也能抑制聚合；冷卻可以使聚合速度變慢。通?？刂七@些因素使聚合在1小時內(nèi)完成，以便使凝膠的性質(zhì)穩(wěn)定。1.1.3 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑的關(guān)系凝膠濃度根據(jù)被分離的物質(zhì)的分子量大小確定。當(dāng)分析一個未知樣品時，常先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠或用410%的凝膠梯度來試測，而后選出適宜的凝膠濃度。凝膠的機械性能、彈性是否適中很重要，膠太軟易斷裂，；太硬則脆，也易折斷。1.2 SDS-凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量的原理蛋白質(zhì)分子在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于所帶凈電荷及分子的大小和形狀等因素。如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS和巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。在蛋白質(zhì)溶液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原；SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合帶來兩個后果：第一，使各種蛋白質(zhì)的SDS-復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，使所有的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時都以同樣的電荷蛋白質(zhì)比向正極移動；第二，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。這兩個原因使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。選擇一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)物，使其形成SDS復(fù)合物。把這些復(fù)合物在相同條件下進(jìn)行電泳分離，分子量小的物質(zhì)泳動距離大，分子量大的物質(zhì)泳動距離小。測定出相對泳動率，用相對泳動率對蛋白質(zhì)的分子量的對數(shù)作圖，它們在一定范圍內(nèi)呈直線關(guān)系。因此可作為標(biāo)準(zhǔn)曲線來檢測樣品蛋白質(zhì)的分子量。1.3 染色原理常用的染料主要有氨基黑10B、考馬斯亮藍(lán)R250、考馬斯亮藍(lán)G250、1-苯胺基-8-萘磺酸，各有優(yōu)缺點，本實驗選用考馬斯亮藍(lán)R250，它的染色靈敏度比氨基黑高5倍，尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色。2 試劑與器材2.1 試劑2.1.1 （1號液）凝膠貯備液丙烯酰胺（Acr） 29.2 g 甲叉雙丙烯酰胺（Bis） 0.8 g加蒸餾水至 100 mL2.1.2 （2號液）濃縮膠緩沖液（0.5molL Tris-HCl 緩沖液，pH 6.8） 三羥甲基氨基甲烷（Tris） 6g加蒸餾水約50 mL，溶解后以6molL HCl調(diào)到 pH 6.8，定容至100 mL2.1.3 （3號液）分離膠緩沖液（1.5 molL Tris-HCl 緩沖液，pH 8.8）三羥甲基氨基甲烷（Tris） 18.15 g加蒸餾水 約50 mL溶解后以6molL HCl調(diào)到 pH 8.8加蒸餾水至 100 mL2.1.4 （4號液）10% 十二烷基硫酸鈉（SDS）水溶液 SDS* （電泳用） 1.0 g蒸餾水 10.0 mL2.1.5 （5號液）過硫酸銨（APS）溶液過硫酸銨 100 mg蒸餾水 1.0 mL臨用前配置2.1.6 （6號液）N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）2.1.6 電泳緩沖液Tris 3 g甘氨酸 14.4 g4號液 10ml加蒸餾水至 1 000 mL2.1.5 樣品緩沖液2號液 0.5 mL4號液 4 mL甘油 2 mL-巰基乙醇 1 mL0.04% 溴酚藍(lán) 0.5 mL加水至10mL2.1.9 染色劑考馬斯亮藍(lán)R250 0.31g甲醇 125mL乙酸 25mL蒸餾水 100mL2.1.10 脫色劑甲醇 250mL乙酸 50mL蒸餾水 200mL2.1.11 保存液 7%乙酸水溶液2.1.12 SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)名稱 分子量（MW）兔磷酸化酶B 97400 牛血清白蛋白 66200兔肌動蛋白 43000牛碳酸酐酶 31000胰蛋白酶抑制劑 20100雞蛋清溶菌酶 144002.2 器材 電泳儀，垂直板電泳槽，酸度計，電導(dǎo)儀，分析天平，真空泵，高速臺式離心機，微量加樣器，染色槽，電爐。3 實驗步驟3.1 制備電泳分離膠根據(jù)樣品分子量的大小，配制所需濃度的分離膠。10100 K分子量的樣品，宜采用T=12%的膠，40200 K分子量的樣品宜采用T=7.5%的膠。本實驗采用T=10%的膠，具體配方如下：分離膠： 1號液 10mL 3號液 7.5 mL 4號液 0.3 mL 蒸餾水 12 mL 6號液 18L 5號液 180L 按順序配制，加完6號液后暫時停下來，臨用時再加5號液，混勻后立即裝入制膠槽，約60 min后就可以凝固。3.2 制備電泳濃縮膠（T=0.38%）濃縮膠：1號液 1.33 mL2號液 2.5 mL4號液 0.1mL蒸餾水 6.1mL6號液 5L5號液 0.1mL按順序配制，加完6號液后暫時停下來，臨用時再加5號液，混勻后立即裝入制膠槽，約30 min后就可以凝固。3.3 制備凝膠板制備凝膠板前先用無水乙醇擦拭玻璃板內(nèi)面。用2.5%瓊脂封邊，并用蒸餾水檢驗是否密封完好。密封好后用吸管緩慢加入分離膠，離頂端約1.5 cm時注入蒸餾水。待界面清晰后，吸去蒸餾水，用吸管吸取配好的濃縮膠沖洗凝固的分離膠面，插入樣品槽模板，用吸管緩慢注入濃縮膠。待凝固好后，在玻璃板上用記號筆劃出點樣槽底線，輕輕拔出樣品槽模板。3.4 樣品制備稱取脫鹽或凍干的蛋白0.01g，加1mL蒸餾水溶解后，10000rpm離心5min，吸取上清50L加等體積的樣品緩沖液，沸水浴加熱3min，取出瞬間離心，上清液備用。3.5 標(biāo)準(zhǔn)蛋白制備方法同樣品制備，本實驗的標(biāo)準(zhǔn)蛋白已經(jīng)制備好，解凍后直接加樣即可。3.6 加樣 用加樣器分別取已高速離心過的樣品液的上清液5、10、15L，依次加到三個樣品槽的底部。用加樣器分別取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)10、20L，依次加到三個樣品槽的底部，標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道的兩側(cè)各加10L樣品緩沖液作空白對照。并作好記錄以免混淆。上好樣后緩慢往樣品槽中加入電極緩沖液，注意不要有氣泡。3.7 電泳連接電泳儀的直流電源，正極連在凝膠板的下端，負(fù)極連在凝膠板的上端，即有樣品的一端。電流值恒為10mA。大約經(jīng)過45 h，樣品緩沖液中的溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)離凝膠底部0.5 cm處，關(guān)閉電源，取下電泳板，并將兩片玻璃板分開，將凝膠板小心移入染色槽中。3.8 染色、脫色 加染色劑染色過夜。傾去染色液，加脫色劑將背景的藍(lán)色脫盡，中間要更換數(shù)次脫色固定液，然后將凝膠板制成干板、掃描。3.9 測量相對泳動率Rm值，計算分子量測量溴酚藍(lán)的泳動距離，將它作為相對泳動率的標(biāo)準(zhǔn)1.0。測量標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)的泳動距離，算出它們的Rm值（Rm=樣品遷移距離染料遷移距離）。以分子量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，Rm值為縱坐標(biāo)，將標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)的坐標(biāo)點連為一條直線，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。算出樣品蛋白質(zhì)的Rm值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量的對數(shù)值，換算出分子量。4 實驗結(jié)果 作出標(biāo)準(zhǔn)曲線及換算樣品蛋白質(zhì)分子量圖1 SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的電泳圖譜 CDE圖1中，標(biāo)準(zhǔn)蛋白產(chǎn)生的6條條帶分別標(biāo)記為a、b、c、d、e、f，卵清蛋白產(chǎn)生的兩條條帶分別標(biāo)記為A、B；人血清蛋白產(chǎn)生的三條帶分別標(biāo)記為C、D、E。5、10分別指樣品蛋白質(zhì)加樣量；在圖中測量出下列值：溴酚藍(lán)的泳動距離D= 9.7; 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的泳動距離：Da =1.0；Db =1.5；Dc =2.6；Dd =3.7；De =5.1；Df =6.2。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對泳動率：Ra =0.103 ；Rb =0.155；Rc =0.268 ；Rd =0.381；Re =0.526 ；Rf =0.639。 卵清蛋白的泳動距離：DA =1.7；DB =3.4；人血清蛋白的泳動距離：DC =1.9；DD =4.2；DE =4.9。 樣品蛋白質(zhì)的相對泳動率：RA=0.175；RB =0.351 ；RC =0.196 ；RD =0.433；RE=0.505 。 (Rm=Dm/D) 表1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的lgMW與Rm值abcdefRm0.6390.5260.3810.2680.1550.103lgMW4.154.304.494.634.824.99各條帶對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對數(shù)值與相對遷移率見表1。根據(jù)表1，以標(biāo)準(zhǔn)分子量的對數(shù)值（lgMW）為橫坐標(biāo)，相對遷移率（Rm）為縱坐標(biāo)，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的坐標(biāo)點連為一條直線，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），并根據(jù)此曲線得趨勢線公式：y= -0.1116x + 0.7359，由該公式計算出樣品蛋白質(zhì)中各個條帶相對應(yīng)的蛋白質(zhì)樣品分子量對數(shù)值，換算出分子量（表2）。5 討論 1.卵清蛋白中分離出2種蛋白質(zhì)，分子量分別為106169.6和2811.9；人血清蛋白中分離出三種蛋白質(zhì)，分子量分別為68865.2、517.6和116.9。表2 樣品蛋白質(zhì)的Rm值、lgMW和分子量（MW） 卵清蛋白 人血清蛋白ABCDERm0.1750.3510.1960.4330.505lgMW5.0263.4494.8382.7142.068MW106169.62811.968865.2517.6116.92. 電泳條帶的粗細(xì)能定性的反映樣品中蛋白質(zhì)含量的相對多少，所以在本實驗中，卵清蛋白所得的2條帶中，B條帶是我們所提取的卵清蛋白的條帶；人血清蛋白所得的3條條帶中，C條帶是我們所提取的人血清蛋白的條帶。3.實驗所得蛋白質(zhì)分子量與實際分子量相差較大，即測量值與真實值相差較大，原因可能如下：1）實驗過程中測量的不準(zhǔn)確；2）分子量的測定不能完全依賴SDS-PAGE，因為一些蛋白質(zhì)的遷移是不規(guī)則的；3) 要做到非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臏y定蛋白質(zhì)分子量，至少應(yīng)在兩個不同的丙烯酰胺凝膠濃度下進(jìn)行電泳；4）從圖1上看，樣品蛋白質(zhì)的兩種加樣量的泳道上都產(chǎn)生了很粗的條帶，這可能是由于樣品濃度太大，給遷移位置的測量造成了困難，這也是造成結(jié)果誤差的一個原因；5）干膠后引起蛋白質(zhì)帶變寬，尤其是厚膠難以準(zhǔn)確對蛋白質(zhì)和指示劑前沿定位。3. 每空的上樣量不能過大，以免樣品溢出，造成各泳道相互污染。4.