小鼠抗核抗體(ANA)IgG酶聯(lián)免疫分析.doc

小鼠抗核抗體(ANA)IgG酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書本試劑盒僅供研究使用產(chǎn)品編號(hào)：CSB-E12912m最低檢測(cè)限：1 ng/ml特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)小鼠anti-ANA IgG，且與其他相關(guān)抗體無(wú)交叉反應(yīng)。有效期：6個(gè)月預(yù)期應(yīng)用：ELISA法半定量測(cè)定小鼠血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中anti-ANA IgG含量。說(shuō)明 1試劑盒保存：-20（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8（頻繁使用時(shí)）。2濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。 3中、英文說(shuō)明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。4剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。實(shí)驗(yàn)原理用純化的核抗原包被酶標(biāo)板，制成固相載體。向微孔中先加入待測(cè)樣品進(jìn)行反應(yīng)，然后再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的anti-ANA IgG呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），評(píng)估樣本中抗體的含量。 。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）。 2. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：120ml/瓶。3. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG稀釋液（HRP-anti-mouse IgG Diluent）：110ml/瓶。4. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG（HRP-anti-mouse IgG）：1120l/瓶（1：100）。5. 底物溶液（TMB Substrate）：110ml/瓶。 6. 濃洗滌液（Wash Buffer）：120ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 7. 終止液（Stop Solution）：110ml/瓶（2N H2SO4）。8. 陰性質(zhì)控品：1800ul/瓶需要而未提供的試劑和器材1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀2. 高速離心機(jī)3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱4. 干凈的試管和Eppendof管5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，最好用多通道移液器6.蒸餾水，容量瓶等標(biāo)本的采集及保存 1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或室溫過(guò)夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8 C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。標(biāo)本的稀釋原則：試驗(yàn)前用樣本緩沖液按1：100的比例稀釋病人樣本。所以使用2ul的樣本+198ul樣本稀釋液加入聚苯乙烯試管中?；旌暇鶆?。陰性質(zhì)控品已經(jīng)準(zhǔn)備好不需要稀釋。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG的稀釋原則：臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10l辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG加990l辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。操作步驟實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。1. 加樣：分別設(shè)陰性孔、待測(cè)樣品孔。陰性孔加陰性質(zhì)控品100l，余孔加待測(cè)樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37反應(yīng)30分鐘。2. 甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200l/每孔，甩干。3. 每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG工作液 100l（取1l生物素標(biāo)記抗體加99l生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37，30分鐘。4. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200l/每孔，甩干。5. 依序每孔加底物溶液90l，37避光顯色10min。6. 依序每孔加終止溶液50l，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。7. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。注：1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。 3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8保存。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠IgG工作液。5. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。計(jì)算1目測(cè)：在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯變藍(lán)者為陽(yáng)性，無(wú)色或藍(lán)色不明顯者為陰性2酶標(biāo)儀檢測(cè)：每孔加終止液50ul，酶標(biāo)儀450nm，空白孔調(diào)零。測(cè)定各孔OD值。臨界值=陰性對(duì)照x2.1陽(yáng)性大于等于臨界值陰性小于臨界值注意事項(xiàng)1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。2. 洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。3. 一次加樣時(shí)間最好