質(zhì)粒DNA 的提取與檢測.doc

質(zhì)粒DNA 的提取與檢測1 概述細菌質(zhì)粒是一些雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，其大小范圍從1kb至2000kb不等。已經(jīng)存在形形色色的細菌類群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒，這些質(zhì)粒都是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的遺傳單位。然而，它們又依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來進行復制和轉(zhuǎn)錄。通常，質(zhì)粒含有編碼某些酶的基因，這些酶事實上在一定的環(huán)境下可能對細菌宿主有利。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對抗生素的抗性、產(chǎn)抗生素、降解復雜有機化合物以及產(chǎn)生大腸桿菌素、腸毒素及限制酶與修飾酶等。質(zhì)粒DNA的復制由負責復制細菌染色體的多種酶來完成，但是不同的質(zhì)粒在宿主體內(nèi)所采用的酶迥然不同，而且在宿主中復制的程度也相差懸殊。一些質(zhì)粒的拷貝數(shù)可高達700個細胞，而另一些則只能維持在每套宿主細胞染色體僅對應l個質(zhì)粒分子的最低水平上?？刂瀑|(zhì)?？截悢?shù)的基因處于包括DNA 復制起點在內(nèi)的一個質(zhì)粒DNA 區(qū)域內(nèi)。通常情況下，一個質(zhì)粒只含有一個復制起始區(qū)（復制子）。目前使用的大多數(shù)載體都帶有一個來源于pMB1質(zhì)粒的復制子。在正常生長條件下，每個細菌細胞中可維持至少1520個拷貝（帶有該復制子的質(zhì)粒）。一般認為，這種多拷貝的質(zhì)粒是以松弛方式進行復制的。pMB1 復制子的復制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半壽期較長的酶。因此，即使蛋白質(zhì)合成并非正在進行，復制依然能夠進行。這樣，當抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素存在時，帶有pMB1復制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復制，最后每個細胞中可以積聚兩三千個拷貝。單向復制從DNA 復制起點開始，由一個RNA 引物所引導，該引物的啟動子位于復制起點上游大約550bp處。新生的RNA與DNA模板形成穩(wěn)定的雜交體，作為RNA 酶H 的底物，由RNA 酶H 切割從而產(chǎn)生引導DNA 合成的引物。而RNA的成熟則由另一個不翻譯的RNA小分子（RNA I）所控制。RNA I編碼RNA的同一區(qū)段的DNA 的互補鏈轉(zhuǎn)錄而來，它可與RNA 結(jié)合，并阻止RNA 折疊為三葉草結(jié)構，而三葉草結(jié)構對于形成穩(wěn)定的DNA-RNA 雜交體又是必不可少的。一個只有63個氨基酸的小蛋白（Rop蛋白）可以增強RNA I和RNA 的結(jié)合，這一蛋白由位于復制起點下游400個核苷酸處的基因所編碼。Rop 蛋白強化了RNA I對復制的負調(diào)節(jié)作用（圖）。圖 帶pMB1 （或ColE1）復制起點的質(zhì)粒在復制起始階段所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的方向及其粗略大小因此，可削弱RNA I 和RNA 之間相互作用的突變，將會增加帶有pMB1 復制子的載體的拷貝數(shù)。這些突變位于rop基因區(qū)或編碼RNA I 和RNA 的復制起點上游區(qū)內(nèi)。例如,pUC質(zhì)粒之所以拷貝數(shù)較高，是因為在RNA I的正常起始位點上游1 個核苷酸的位置帶有G-A突變，結(jié)果RNA I轉(zhuǎn)錄物的起始位點位于正常起始位點下游3個核苷酸的位置。RNA I 5-端的完整對于RNA I和RNA 間的相互作用至關重要。因此，pUC 質(zhì)?？截悢?shù)的增加看起來很可能是由縮短的RNA I和RNA 結(jié)合效率降低所致。除了控制拷貝數(shù)以外，質(zhì)粒上編碼RNA I、RNA 和Rop蛋白的區(qū)段也決定兩個不同的質(zhì)粒是否可以在同一個細菌細胞中共存。利用同一復制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定地和平共處，可以稱之為不相容質(zhì)粒。當兩個上述質(zhì)粒被導入同一細胞時，它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中會彼此競爭。由于質(zhì)粒是從細胞內(nèi)的質(zhì)粒庫中隨機選取出來進行復制的，所以兩個不同的質(zhì)粒在一個單細胞中的拷貝數(shù)并不是總能保持相同。最初在隨機過程中產(chǎn)生的微小差異，將很快導致兩種質(zhì)粒在拷貝數(shù)上更嚴重的失衡。在一些細胞中，一種質(zhì)粒處于優(yōu)勢；而在另一些細胞中，與之不相容的另一種質(zhì)粒卻占盡上風。細菌生長幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會喪失殆盡，在原始細胞的后代中可能含有兩種質(zhì)粒的任意一種，但不會兼而有之。在分子克隆的所有操作中最基本的或許要算核酸的分離純化，分離純化核酸總的原則是： 應保證核酸的一級結(jié)構完整性； 排除其他分子的污染。為了保證對核酸結(jié)構與功能的研究，完整的一級結(jié)構是最基本的要求，因為遺傳信息全部貯存在一級結(jié)構中。核酸的一級結(jié)構還決定其高級結(jié)構的形式及其和其他大分子結(jié)構結(jié)合的方式。核酸的純化方式應符合以下三個條件： 核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子； 其他生物大分子（如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）的污染應降低到最低程度； 排除其他核酸分子的污染，如提取DNA 分子時，應去除RNA 分子，反之亦然。為了保證分離核酸的完整性和純度，在實驗過程中，應注意以下事宜。 盡量簡化操作步驟、縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞。 減少化學因素對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH410 的條件下進行。 減少物理因素對核酸的降解，物理降解因素主要是機械剪切力，其次是高溫。機械剪切力的主要危害對象是大分子量的線型DNA 分子，如真核細胞的染色體DNA ；對分子量小的環(huán)狀DNA 分子，如質(zhì)粒DNA 及RNA 分子則威脅相對少一些。高溫（如長時間的煮沸）對核酸的完整性有很大破壞，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的有些化學鍵也有破壞作用。核酸提取過程中，常規(guī)操作溫度為04 ，此溫度環(huán)境可降低核酸酶的活性與降解反應速率，減少其對核酸的生物降解。 防止核酸的生物降解，細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶會降解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構。其中DNA 酶需要二價金屬離子Mg2+、Ca2+的激活，使用二價金屬離子螯合劑EDTA、檸檬酸鹽基本上可以抑制DNA 酶的活性。不同的研究目的對DNA 的純度和量的要求不盡相同，一個好的DNA 分離程序應符合以下三個主要標準。 所得的DNA 的純度應滿足下游操作的要求，用于RFLP 分析的DNA ，其純度的要求為可用限制性內(nèi)切酶完全酶解并可成功地轉(zhuǎn)移到膜上進行Southern 雜交；用于PCR 分析的DNA 則不應含干擾PCR 反應的污染物，PCR 過程對模板的要求不是很高，模板不需要達到超純。大量的實驗數(shù)據(jù)表明，存在一定量的蛋白質(zhì)或SDS等對實驗過程影響不大，所以只要沒有交叉污染，模板DNA 的制備可以不必像克隆、酶切、連接、標記等反應所用DNA的制備那樣嚴格。但在DNA 模板中，不能有影響擴增反應的物質(zhì)存在。例如蛋白酶、核酸酶、結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)等；另一類是尿素、十二烷基磺酸鈉、卟琳類物質(zhì)等；還有一類是二價金屬離子的螯合劑（如EDTA 等），會與鎂離子絡合，影響Taq DNA 聚合酶的活性。上述物質(zhì)的存在會影響擴增效果，甚至使擴增失敗。 所得的DNA應當完整，電泳檢查時應能得到精確性高、重復性好的遷移帶型。 所得DNA應有足夠的量。因此，核酸提取的主要步驟不外乎破碎細胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)，純化核酸等。核酸提取的方案，應根據(jù)具體生物材料和待提取的核酸分子的特點而定，然而一些核酸純化和濃縮的基本方法都是一致的。核酸純化的關鍵步驟是去除蛋白質(zhì)，通常只要用苯酚氯仿和氯仿抽提核酸的水溶液即可。每當需要把克隆操作中的某一步所用的酶滅活或去除以便進行下一步操作時，即可進行這種抽提。然而，如果要從細胞裂解液等復雜的混合物中純化核酸，則需要增加一些處理措施。這些情況下，通常先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)，然后再用有機溶劑抽提。這些廣譜的蛋白水解酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶K等，它們對多種天然蛋白均有活性。從核酸溶液中去除蛋白質(zhì)的標準方法是先用苯酚氯仿抽提，然后再用氯仿抽提，這是因為使用兩種不同的有機溶劑去除蛋白質(zhì)比用單一有機溶劑效果更佳。此外，苯酚雖能有效地使蛋白質(zhì)變性，卻不能完全地抑制RNA 酶的活性，而且它還能溶解帶有長poly ( A）的RNA 分子。使用苯酚氯仿異戊醇（2524 1）混合液可使這兩個問題迎刃而解。然后再用氯仿抽提則可去除核酸制品中殘留的痕量苯酚。應用最為廣泛的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下形成的核酸沉淀物，可通過離心進行回收并按所需濃度重新溶解于適當?shù)木彌_液中。這一技術不但快速，而且對含量極低（皮克級）的DNA和RNA也可定量回收。主要的可變因素包括以下三個。(l）形成沉淀的溫度在 0 且沒有載體存在的情況下，濃度低至2Ong / mL的DNA也能形成沉淀，用微量離心機進行離心即可定量回收。( 2 ）在沉淀混合液中使用的單價陽離子的類型和濃度 常用于沉淀核酸的陽離子及其濃度表，其選擇很大程度上取決于人們的習慣。表 常用于沉淀核酸的陽離子及其濃度提供陽離子的化合物貯存液濃度/molL-1終濃度/molL-1乙酸銨LiClNaCl乙酸鈉10.08.05.03.02.02.50.80.20.3乙酸銨常用于減少dNTP 的共沉淀。例如，在2mol/L乙酸銨存在下連續(xù)沉淀兩次，可從DNA 制品中除去99 的dNTP。但是，如果沉淀的核酸將要用于磷酸化則不能使用乙酸銨，因為銨離子會抑制T4 噬菌體多核苷酸激酶的活性。若用較高濃度的乙醇沉淀核酸，例如在沉淀RNA 時，常用LiCl 。LiCl在乙醇溶液中的溶解度很高而且不隨核酸共沉淀。如果沉淀的RNA 將用于無細胞翻譯或反轉(zhuǎn)錄過程，則應避免使用LiCl。在大多數(shù)無細胞體系中，氯離子可抑制蛋白質(zhì)合成的起始，也抑制依賴于RNA的DNA聚合酶活性。由于不同大小的RNA 在高濃度LiCl中的溶解度各不相同，故LiCl可用于選擇性地純化大分子RNA。含有SDS的DNA樣品應使用NaCl ( 0.2mol /L）進行沉淀，這時去污劑在70的乙醇中仍保持可溶狀態(tài)。DNA和RNA的沉淀大多使用乙酸鈉（0.3mol /L , pH5.2）。（3） 離心的時間與速度 在沒有載體DNA的情況下，用微量離心機于04以1200g離心15min，可定量回收含量低于20ng /mL的核酸。然而，處理更低濃度的DNA或較短（少于100個核苷酸）的片斷時，則應延長離心時間以使核酸沉淀緊貼于離心管上。用微量離心機離心以后，并非所有的DNA都聚集于管底，多達50的DNA可附著于管壁上。要回收所有的DNA，就必須要用液滴來回沖洗管壁的相應扇面?？墒褂?倍體積的異丙醇代替2 倍體積的乙醇來沉淀DNA，使用異丙醇的優(yōu)點是待離心的體積較小。但是，異丙醇的揮發(fā)性比乙醇低，因而更難去除。此外，使用異丙醇時，蔗糖或氯化鈉等溶質(zhì)更容易與DNA共沉淀。一般來說，乙醇沉淀更受青睞，只有必須盡量減少溶液體積時除外。提取質(zhì)粒DNA有多種方法，所有這些方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細菌；分離和純化質(zhì)粒DNA?？刹捎萌芫钙茐木w細胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）可使細胞壁裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS處理后，在堿性條件下，細菌染色體DNA和質(zhì)粒DNA都變性，而閉環(huán)的質(zhì)粒DNA由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。當加人乙酸鉀等物質(zhì)（在中性條件下）時，巨大的染色體DNA分子難以復性，而質(zhì)粒DNA很快得以復性。同時，在高鹽濃度的條件下，宿主染色體DNA、蛋白質(zhì)等形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構，通過離心可去除大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，而質(zhì)粒DNA仍留在上清中，然后采用異丙醇或乙醇沉淀可得到質(zhì)粒DNA。通常在DNA樣品的分析中，往往通過測量OD值來確定其濃度。DNA的吸收峰在260nm 處，蛋白質(zhì)的吸收峰在280nm處。用標準樣品測得，在波長260nm 下，1g / mL DNA鈉鹽溶液的OD值為0.02，即在OD260=1時，雙鏈DNA含量為50g /mL ，單鏈DNA與RNA 含量為40g /mL，寡聚核苷酸的含量為30g /mL（由于底物不同而有差異）。這些標準數(shù)據(jù)使人們能定量測定核酸，但是當核酸的GC百分含量發(fā)生較大變化時，也會導致這些數(shù)據(jù)的偏差。紫外分光光度法除可以測定核酸的含量外，還可以測定核酸的純度。已知核酸在260nm 處有堿基引起的強吸收峰，230nm處有一吸收低谷，蛋白質(zhì)在280nm處有一個由酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸引起的吸收峰，所以OD260OD280的值能說明蛋白質(zhì)對核酸的污染程度。一般認為純凈DNA 的OD260OD280約為1.8，而純凈RNA的OD260OD280約為1.8 2.0，樣品中若含有蛋白質(zhì)，會使OD260OD280的值下降。當OD260OD280小于1.75時，該樣品可適當稀釋，用氯仿異戊醇抽提，重新用無水乙醇沉淀后再進行測定。當DNA 樣品的OD260OD280大于2時，則RNA濃度過高，需要去除RNA。但這樣的評估對于不純的樣品沒有意義，因為若DNA同時含有蛋白質(zhì)和RNA也會使比值落在1.8左右，這時應進行電泳鑒定，以排除蛋白質(zhì)和RNA同時存在的可能性。此外，還可以輔以OD230測定，OD260/OD230的值應大于2.0，小于該值時表明樣品中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)。所提取的質(zhì)粒DNA可通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。一般情況下，提取的質(zhì)粒為3 條帶（圖）。在細胞內(nèi)，質(zhì)粒DNA是共價閉環(huán)DNA (covalently Closed circular DNA )，常以超螺旋形式存在。如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處缺刻，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開環(huán)DNA（open circular DNA )；若兩條鏈在同一處或相近的部位斷裂，則變成線性DNA 分子。在電泳時，同一質(zhì)粒的電泳速度因DNA的構型不同而異，其速度從大到小的次序為：cccDNA線性DNA ocDNA，共價閉環(huán)DNA的泳動速度最快。但在優(yōu)化條件下，如在冰浴中或用試劑盒提取時，可以只出現(xiàn)一條帶或主要出現(xiàn)一條帶，即超螺旋帶。圖 質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳圖MHind ；1，2，3，4-pBI121；5，6pActlIsGFP-1提取的質(zhì)粒DNA 經(jīng)RNase 消化后，可直接使用或經(jīng)進一步純化后用于其他分子生物學實驗。純化后的質(zhì)粒DNA可用分光光度計檢測其純度和濃度。本實驗采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，包括載體質(zhì)粒DNA和重組質(zhì)粒DNA，用于進一步的轉(zhuǎn)化、酶切和PCR等實驗。2. 目的掌握質(zhì)粒DNA 的提取和檢測方法。3. 主要試劑和材料(1)LB液體培養(yǎng)基 胰蛋白胨10g /L，酵母提取物5g /L ,NaCl 10g/L, pH7.0。(2)STE溶液 0.lmol/L NaCI, 10mmol/L TrisCl ( pH8.0), 1mmol / L EDTA ( pH8.0）。(3)溶液I 50mmol/L 葡萄糖，25rnmol/L TrisCl(pH8.0 ) ,10mmol / LEDTA ( pH8.0）。(4)溶液 0.2mol /L NaOH, l % SDS；使用前用0.4mol / L NaOH 和2%SDS等量混合。(5)溶液 5mol/L 乙酸鉀60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL。(6)TE 10mmol/L TrisCl(pH8.0),lmmol/L EDTA (pH8.0）。(7)其他 氯仿異戊醇（24 : 1），無水乙醇，70乙醇。4 主要儀器設備恒溫搖床，離心機，渦旋振蕩器，微量移液器，水浴鍋。5. 實驗步驟（1）從選擇性培養(yǎng)平板上挑取單菌落，移至含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 振蕩培養(yǎng)過夜（不要超過16h ）。（2）將1.4mL培養(yǎng)物移至1.5mL離心管中，12000r / min離心lmin 。（3）棄上清（一次性地將液體倒出，并用濾紙吸凈管口殘余的液體，盡量避免液體重新流回管底），用lmL STE溶液重懸細菌沉淀，12000r/min離心