《血紅蛋白的提取和分離》課件.ppt

課題3血紅蛋白的提取和分離 血紅蛋白含有四條肽鏈 每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團 此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳 血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色 一 基礎(chǔ)知識 學(xué)生活動1 1 分離生物大分子的基本思路是什么 2 不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異 3 本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)蛋白哪方面的差異進行提純 4 為什么不用雞的血紅細胞而用人的血紅細胞作為實驗材料 5 用什么方法分離相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì) 一 基礎(chǔ)知識 蛋白質(zhì)提取和分離原理 蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù) 蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì) 形狀 大小 電荷性質(zhì)和多少 溶解度 吸附性質(zhì) 親和力等千差萬別 1 原理 2 材料 大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙 路程短 流動快 小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部 路程長 流動慢 多孔性的多糖類化合物 如葡聚糖 瓊脂糖 一 凝膠色譜法 3 分離過程 洗脫 從色譜柱上端不斷注入緩沖液 促使蛋白質(zhì)分子的差速流動 一 凝膠色譜法 1 什么是凝膠 2 什么是凝膠色譜法 學(xué)生活動2 3 凝膠色譜法的原理是什么 4 請用自己的話總結(jié)出凝膠色譜法分離相對分子質(zhì)量不同蛋白質(zhì)的具體過程 1 什么是緩沖液 2 緩沖液的作用是什么 學(xué)生活動3 3 緩沖液是如何配制的 你所學(xué)過的人體血液的緩沖物質(zhì)有哪些 4 本實驗加的是什么緩沖液 為何要加緩沖液 二 緩沖溶液 由弱酸和相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成 如H2CO3 NaHCO3 醋酸 醋酸鈉 NaH2PO4 Na2HPO4等 緩沖溶液 洗脫劑組成 配制 作用 調(diào)節(jié)緩沖劑的比例 可配制不同pH的緩沖液 抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定 二 緩沖溶液 1 什么是電泳 2 影響電泳遷移速度的因素有哪些 學(xué)生活動4 4 電泳分離各種分子的原理是什么 三 電泳 3 如何消除電荷對電泳遷移速度的影響 5 請描述電泳的過程 2 凝膠電泳法 1 原理 不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì) 電量 形狀和大小不同 在電場中受到的作用力大小 方向 阻力不同 導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同 影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素 三 電泳 1 電泳的概念 指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程 影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素 在一定pH下 使蛋白質(zhì)基團帶上正電或負電 加入帶負電荷多的SDS 形成 蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物 使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小 2 分離方法 3 分離過程 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳等 三 電泳 電泳檢測結(jié)果 二 實驗操作 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步 1 樣品處理 包括洗滌紅細胞 血紅蛋白釋放 離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液 2 粗分離 透析除去分子較小的雜質(zhì) 3 純化 通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去 4 純度鑒定 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定 一 樣品處理 1 紅細胞的洗滌 目的是去除雜蛋白 要加入檸檬酸鈉防止血液凝固 離心將血液分層 用膠頭吸管吸出黃色血漿 用生理鹽水洗滌 2 血紅蛋白的釋放 在蒸餾水和甲苯作用下 紅細胞破裂釋放3 分離血紅蛋白溶液 離心分層 濾紙過濾去除脂溶性沉淀層 分液漏斗分出紅色透明液體 4 透析 裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中 PH為7 0 透析 二 實驗操作 跳轉(zhuǎn) 血液組成成分 閱讀思考 血液由 和 兩部分組成 血細胞中 細胞數(shù)量最多 紅細胞的含量最高的有機化合物是 該化合物是由 和 構(gòu)成的 其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的 基團 返回 1 洗滌紅細胞 閱讀思考 洗滌的目的是什么 洗滌過程 血液100mL 重復(fù)洗滌3次 直至上清液沒有黃色 采集得到雞血 初次離心后的結(jié)果 3次洗滌后的結(jié)果 返回 2 釋放血紅蛋白 閱讀思考 釋放血紅蛋白過程中 在洗滌好的紅細胞加入了哪些物質(zhì) 為了加速釋放過程 采取了什么措施 目的分析 蒸餾水的作用是 加入甲苯的作用是 充分攪拌的目的是 使紅細胞大量吸水脹裂 溶解紅細胞的細胞膜 加速紅細胞的破裂 2 血紅蛋白的釋放 加蒸餾水到原血液體積 再加40 體積的甲苯 置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘 加速細胞破裂 細胞破裂釋放出血紅蛋白 磁力攪拌器 返回 3 分離血紅蛋白 分離過程 紅細胞混合液 燒杯 3 分離血紅蛋白溶液 過程 將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi) 以2000r min的速度離心10min 試管中溶液層次 第1層 最上層 甲苯層 無色透明 第2層 中上層 脂溶性物質(zhì)沉淀層 白色薄層固體 第3層 中下層 血紅蛋白的水溶液層 紅色透明液體 第4層 最下層 雜質(zhì)沉淀層 暗紅色 分離 用濾紙過濾 除去脂溶性沉淀層 于分液漏斗中靜置片刻后 分出下層的紅色透明液體 甲苯層 無色透明 白色薄層固體 紅色透明液體 雜質(zhì)沉淀層 暗紅色 試管中溶液層次 返回 4 透析血紅蛋白 利用透析袋透析 透析過程 返回 純化 凝膠色譜操作 1 凝膠色譜柱的制作 2 凝膠色譜柱的裝填 教材圖5 19 3 樣品的加入和洗脫 返回 二 凝膠色譜操作 1 凝膠色譜柱的制作 取長40厘米 內(nèi)徑1 6厘米的玻璃管 兩端需用砂紙磨平 底塞的制作 打孔 挖出凹穴 安裝移液管頭部 覆蓋尼龍網(wǎng) 再用100目尼龍紗包好 插到玻璃管的一端 注意事項 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面 否則難以鋪實尼龍網(wǎng) 還會導(dǎo)致液體殘留 蛋白質(zhì)分離不徹底 頂塞的制作 打孔 安裝玻璃管 組裝 將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體 安裝其他附屬結(jié)構(gòu) 裝配好的凝膠柱 返回 材料 交聯(lián)葡聚糖凝膠G 75 20mmol L磷酸緩沖液裝填 2 凝膠色譜柱的裝填 立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h 洗滌平衡 一次性緩慢倒入 輕輕敲打 裝填懸浮液 凝膠顆粒 洗脫液 沸水浴 凝膠顆粒 蒸餾水 充分溶脹 根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量 色譜柱垂直固定在支架上 配制懸浮液 計算稱量凝膠 固定色譜柱 2 凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇 A 材料 交聯(lián)葡聚糖凝膠 G 75 B 代表意義 G 表示凝膠的交聯(lián)程度 膨脹程度及分離范圍 75表示凝膠的得水值 即每克凝膠膨脹時吸水7 5克 凝膠的前處理 配制凝膠懸浮液 計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后 配成凝膠懸浮液 凝膠色譜柱的裝填方法 A 固定 將色譜柱裝置固定在支架上 B 裝填 將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi) 裝填時輕輕敲動色譜柱 使凝膠填裝均勻 注意 1 凝膠裝填時盡量緊密 以降低凝膠顆粒之間的空隙 2 裝填凝膠柱時不得有氣泡存在 因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序 降低分離效果 洗滌平衡 裝填完畢后 立即用緩沖液洗脫瓶 在50cm高的操作壓下 用300ml的20mmol l的磷酸緩沖液 pH為7 0 充分洗滌平衡12小時 注意 1 洗脫液面不要低于凝膠表面 否則可能有氣泡混入 影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果 2 不能發(fā)生洗脫液流干 露出凝膠顆粒的現(xiàn)象 返回 3 樣品加入與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面 打開下端出口 使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊 關(guān)閉出口 滴加透析樣品 吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端 滴加樣品時 吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣 同時注意不要破壞凝膠面 樣品滲入凝膠床 加樣后打開下端出口 使樣品滲入凝膠床內(nèi) 等樣品完全進入凝膠層后 關(guān)閉下端出口 洗脫 小心加入pH 7 0的20mmol l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度 連接緩沖液洗脫瓶 打開下端出口進行洗脫 收集 待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時 用試管收集流出液 每5ml收集一試管 連續(xù)收集 在分離過程中 如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動 說明色譜柱制作成功 注意 正確的加樣操作 1 不要觸及并破壞凝膠面 2 貼壁加樣 3 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動 3 樣品的加入和洗脫 3 樣品加入與洗脫 注意 正確的加樣操作是 1 不要觸及并破壞凝膠面 2 貼壁加樣 3 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動 收集得到的純化后的血紅蛋白 注意事項 1 紅細胞的洗滌 洗滌次數(shù)不能過少 低速 短時離心 2 凝膠的預(yù)處理 沸水浴法時間短 還能除去微生物和氣泡3 色譜柱的裝填 裝填盡量緊密 降低顆粒間隙 無氣泡 洗脫液不能斷流 4 色譜柱成功標(biāo)志 紅色區(qū)帶均勻一致地移動 返回 觀察你處理的血液樣品離心后是否分層 見教科書圖5 18 如果分層不明顯 可能是洗滌次數(shù)少 未能除去血漿蛋白的原因 此外 離心速度過高和時間過長 會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀 也得不到純凈的紅細胞 影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度 三 實驗結(jié)果分析與評價 1 你是否完成了對血液樣品的處理 你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎 2 你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生 你的色譜柱裝填得成功嗎 你是如何判斷的 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì) 因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈 檢查凝膠是否裝填得均勻 此外 還可以加入大分子的有色物質(zhì) 例如藍色葡聚糖 2000或紅色葡聚糖 觀察色帶移動的情況 如果色帶均勻 狹窄 平整 說明凝膠色譜柱的性能良好 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡 輕輕敲打柱體以消除氣泡 消除不了時要重新裝柱 如果凝膠色譜柱裝填得很成功 分離操作也正確的話 能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻 狹窄 平整 隨著洗脫液緩慢流出 如果紅色區(qū)帶歪曲 散亂 變寬 說明分離的效果不好 這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān) 3 你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中 紅色區(qū)帶的移動嗎 請描述紅色區(qū)帶的移動情況 并據(jù)此判斷分離效果 知識總結(jié) 血紅蛋白的提取和分離 教學(xué)反饋 1 凝膠色譜法是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法 A分子的大小B相對分子質(zhì)量的大小C帶電荷的多少D溶解度2 緩沖液的作用是 在一定范圍內(nèi) 抵制外界的影響來維持 基本不變 A溫度BpHC滲透壓D氧氣濃度 B B 3 電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷 的電極移動 A相同B相反C相對D相向4 哺乳動物和人的成熟的紅細胞中的 與氧氣的運輸有關(guān) A血紅蛋白B肌紅蛋白C肌動蛋白D肌球蛋白 B A 5 血液由血漿和各種血細胞組成 其中 的含量最多 A白細胞B血小板C紅細胞D淋巴細胞6 為防止血液凝固 在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血劑 A NaClB 甲苯C 蒸餾水D 檸檬酸鈉 C D 7 將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中 離心后 可以明顯看到試管中的溶液分為4層 其中第3層是 A無色透明的甲苯層B脂溶性物質(zhì)的沉淀層C血紅蛋白的水溶液D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物 C 1 隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代 對蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入 首先要做的一步是A弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D獲得高純度的蛋白質(zhì) 練習(xí)鞏固 2 用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中 關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述 正確的是A相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于