熒光定量PCR檢測項目.ppt

熒光定量PCR檢測項目 HBV DNA定量乙肝基因分型乙肝拉米夫定耐藥HCV RNA定量病毒性腦炎 實時熒光定量PCR方法 TaqMan法 方法 TaqMan法TaqMan 水解型雜交探針 5 端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán) Reporter R 如FAM VIC等3 端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) Quencher Q 探針完整 R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 無熒光 R與Q分開 發(fā)熒光Taq酶有5 3 外切核酸酶活性 可水解探針 5 3 5 5 3 5 ForwardPrimer ReversePrimer TaqMan Probe R Q Taqman實時PCR的反應(yīng)過程 Displacement 5 3 5 5 3 5 ForwardPrimer ReversePrimer R Q Hydrolysis 5 3 5 5 3 5 Q R PolymerizationCompleted 5 3 5 5 3 5 R Q 每擴(kuò)增一條DNA分子 釋放一個熒光信號 可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光 實時熒光定量PCR定義 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán) 利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程 最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 實時熒光定量PCR原理實時原理 常規(guī)PCR技術(shù) 對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量 無法對擴(kuò)增反應(yīng)實時檢測 實時定量PCR技術(shù) 利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化 通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析 實時熒光定量PCR原理定量原理 如何對起始模板定量 通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析 介紹三個概念 擴(kuò)增曲線 熒光閾值 Ct值 擴(kuò)增曲線 熒光閾值 熒光信號閾值 threshold 前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號 baseline 即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3 15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動設(shè)置 原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值 同時要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段 并且保證回歸系數(shù)大于0 99真正的信號 熒光信號超過域值 Ct值 Ct值的定義 PCR擴(kuò)增過程中 擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù) Ct值的重現(xiàn)性 Ct值的特點 相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增 終點處產(chǎn)物量不恒定 Ct值則極具重現(xiàn)性 定量原理 理想的PCR反應(yīng) X X0 2n非理想的PCR反應(yīng) X X0 1 Ex nn 擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X 第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0 初始模板量Ex 擴(kuò)增效率 定量原理 在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時 XCt X0 1 Ex Ct M 1 XCt 熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時擴(kuò)增產(chǎn)物的量 在閾值線設(shè)定以后 它是一個常數(shù) 我們設(shè)為M方程式 1 兩邊同時取對數(shù)得 logM logX0 1 Ex Ct 2 整理方程式 2 得 logX0 log 1 Ex Ct logM 3 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系 根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量 標(biāo)準(zhǔn)曲線 模板DNA量越多 熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少 即Ct值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系 通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)樣品Ct值 就可以計算出樣品中所含的模板量 確定未知樣品的C t 值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C t 值推算出其初始量 絕對定量 標(biāo)本采集和運送 血液標(biāo)本 用2ml真空采集管或1 5ml高壓滅菌離心管采集血液標(biāo)本 血標(biāo)本采集后在2小時內(nèi)送達(dá)實驗室 HCV采用EDTA抗凝的血漿 離心 檢驗單與標(biāo)本一道 后用一次性吸管吸取血清或血漿加入經(jīng)消毒的1 5ml的離心管中 腦脊液 由臨床醫(yī)生采集后放入消毒的試管中及時送檢 用于臨床標(biāo)本采集的容器如試管或離心管 均應(yīng)使用前高壓滅菌和密封標(biāo)本采集后 應(yīng)盡可能快的送至實驗室 如運送時間需2小時以上 必須用冰盒送至實驗室 標(biāo)本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑 如用于RNA測定加入4mol L異硫氰酸胍鹽 GITC 的血清 漿 標(biāo)本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等 則可在室溫下運送或郵寄 注 RNA采用EDTA抗凝的全血標(biāo)本 抗凝后6小時內(nèi)分離血漿 如使用血清標(biāo)本則盡快 2小時內(nèi) 分離血清 嚴(yán)禁使用肝素抗凝 定量檢測的臨床意義 治療前進(jìn)行病毒定量檢測 指導(dǎo)選擇抗病毒藥物 避免盲目用藥 治療后定量PCR直接準(zhǔn)確地測定體內(nèi)病毒數(shù)量 有助于療效的判斷 懷孕前進(jìn)行定量PCR測定 有助于選擇有利的懷孕時機(jī) HBV基因分型 HBV基因型是根據(jù)HBV病毒核酸異源性 8 進(jìn)行分型分為A B C D E F G H等8種亞洲主要為B型以及C型感染HBV后的臨床經(jīng)過與不同基因型有關(guān) HBV基因型的臨床意義 HBV標(biāo)志物清除與B基因型相比 C基因型有更高的HBeAg陽性率 分別為16 與53 基因型的自發(fā)性HBeAg清除要比C基因型早10年 并且在HBeAg清除后 肝臟生物化學(xué)指標(biāo)持續(xù)正常 病毒致病性HBsAg陽性者中 C基因型比B基因型的肝功能異常更為常見 C基因型引起的臨床表現(xiàn)及組織學(xué)損傷更嚴(yán)重 乙型肝炎的病程及轉(zhuǎn)歸亞洲無癥狀HBV攜帶中 與B基因型比較 C基因型在肝硬化及50歲以上的肝細(xì)胞癌患者中比例較高 而B基因型與50歲以下 特別是35歲以下的肝細(xì)胞癌患者有關(guān) 藥物敏感性給予干擾素治療時 B基因型的完全應(yīng)答率達(dá)到C基因型的3倍HBeAg陽性乙型肝炎患者使用拉米呋定治療時 發(fā)現(xiàn)B基因型患者的HBeAg HBeAb轉(zhuǎn)陰率達(dá)到C基因型的兩倍 HBV不同基因型比較 B型C型流行性低高HBeAg陽性率低高HBeAg自然清除時間短長HBVDNA載量低高致病性輕重HCC發(fā)生率低 低年齡組高 高 高年齡組高 干擾素治療完全應(yīng)答率高低抗病毒治療效果好差肝癌手術(shù)治療預(yù)后好差癌栓栓塞治療效果好差 注意事項 在病毒定量 103時 檢測基因分型更有意義可能出現(xiàn)分型結(jié)果出現(xiàn)陰性 排除本身病毒量低的原因外 患者HBV基因型可能為非B C型 HBV 拉米夫定 拉米夫定 Lamivudine Heptodin 有效 核苷類高效抗乙肝病毒藥物 可迅速降低HBV DNA的滴度 改善肝臟組織的病變 還可能阻止纖維化的進(jìn)程 終止肝硬化的發(fā)展 耐藥 長期服用 會引起HBV基因突變 造成HBV對藥物敏感性大大降低 從而血清中HBV復(fù)制恢復(fù)活躍 滴度升高 耐藥機(jī)理 HBV聚合酶中Y 酪氨酸 M 蛋氨酸 D 天門冬氨酸 D 天門冬氨酸 變異毒株的生物特性 對拉米夫定抗病毒效應(yīng)的敏感性降低至1 300 DNA減少僅1 7 臨床癥狀 血清ALT水平暫時上升 HBV DNA的濃度上升 并有輕度乏力 惡心等肝臟炎癥損傷加劇等癥狀 I 異亮氨酸 V 纈氨酸 拉米夫定耐藥性 發(fā)生率 治療慢性乙型肝炎6個月后出現(xiàn)耐藥性 在亞洲慢性乙型肝炎病人用拉米夫定1年 對拉米夫定敏感性降低的病毒變異發(fā)生率達(dá)14 甚至可達(dá)39 定義 在持續(xù)治療中血清HBVDNA再現(xiàn)耐藥差異 檢測靈敏度基礎(chǔ)病毒水平是否多次 多種抗病毒治療 拉米夫定耐藥的臨床意義 耐藥后的臨床情況 發(fā)生耐藥變異后1 4個月內(nèi)雖都有病毒再現(xiàn) 病人的情況也有可能大不相同 無癥狀變異病毒攜帶部分病人可能只是病毒再現(xiàn) 血清轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)正常 所以繼續(xù)服藥仍能抑制HBV野生毒株 攜帶變異毒株因其生活力低 因此并不會發(fā)病 野生毒株轉(zhuǎn)換有一部分病人停用拉米夫定3 4個月后 變異