第四章電泳技術(shù).ppt

第四章電泳技術(shù) 1電泳 帶電粒子在電場中向著與其本身電荷相反的電極移動(dòng)的過程 2電泳技術(shù)優(yōu)點(diǎn) 快速 準(zhǔn)確 重現(xiàn)性好3電泳方法分類按電場分 常壓 500V 適用小分子 支持體分 自由電泳 區(qū)帶電泳儀器裝置分 水平式 垂直式 懸架式4電泳條件 水溶液 緩沖液 支持物 區(qū)帶電泳 電場 電泳儀 電泳槽 一電泳的基本原理 電泳分離 移動(dòng)方向 帶電性質(zhì)決定泳動(dòng)度 帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下的移動(dòng)速度 v E d t V l dl Vt影響 的因素 1顆粒本身 帶電 大小 形狀2外界因素 電場強(qiáng)度E pH 離子強(qiáng)度I 電滲 緩沖液粘度及溫度等 二紙電泳 以濾紙為支持體的電泳技術(shù)操作要點(diǎn) 1選擇緩沖液對(duì)顯色劑和紫外光吸收等觀察區(qū)帶的方法無影響A分離蛋白質(zhì) pI 5 選pH8 6的緩沖液 巴比妥緩沖液pH8 6 硼酸pH8 6 磷酸pH7 4 B分離氨基酸 鄰苯二甲酸氫鈉 磷酸 醋酸 pH5 9C分離核苷酸巴比妥 醋酸pH2 5 檸檬酸pH2 3D分離糖類 HAC NaAC pH3 5 2濾紙的選擇與處理層析用濾紙 紙寬2 3cm 樣品組分 長短影響電場強(qiáng)度 3點(diǎn)樣點(diǎn)圓點(diǎn) 量少 點(diǎn)條狀 一般 點(diǎn)中間 未知樣品 點(diǎn)一邊 已知樣品 干法 濕法4電泳電橋水平 加蓋 電壓穩(wěn)定 注意時(shí)間5顯色及分析蛋白 溴酚蘭 氨黑10B 偶氮胭脂紅BAa 茚三酮 靛紅核酸 紫外光下觀察一般洗脫定量 三薄膜電泳 支持體 薄膜優(yōu)點(diǎn) 分辨力較高 簡便 快速 區(qū)帶清晰 易于定量 便于保存廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和同工酶等的分離分析操作1薄膜的處理與放置2點(diǎn)樣平衡3電泳 E10 25V cm 0 5 2h4顯色 四薄層電泳 將支持物與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層進(jìn)行電泳 常用支持物 淀粉 瓊脂 纖維素粉 硅膠等操作 1緩沖液選擇離子強(qiáng)度較高的緩沖液2支持物處理精制品3薄層板制作4加樣 挖溝 混合樣品 填埋5電泳6分析 印染法 五凝膠電泳 支持物 多孔凝膠聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖凝膠等具有電泳和分子篩的雙重作用 分辨力高最常用聚丙烯酰胺凝膠 原因 機(jī)械強(qiáng)度好 透明有彈性 穩(wěn)定 無吸附作用和電滲作用 可制成不同孔徑的凝膠 分類 垂直管型盤狀電泳 垂直板型電泳 連續(xù) 不連續(xù) 梯度 SDS凝膠電泳 1聚丙烯酰胺凝膠的制備丙稀酰胺 單體 N N 甲叉雙丙稀酰胺 交聯(lián)劑 催化劑 聚合催化劑 1 過硫酸銨 四甲基乙二胺 TEMED 2 核黃素 VitB2 光改變單體濃度可改變凝膠孔徑交聯(lián)劑對(duì)孔徑有影響 5 最小根據(jù)要分離物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量選擇合適的單體濃度 2不連續(xù)電泳中樣品壓縮成層的原理不連續(xù)電泳含兩層或三層不同孔徑的凝膠 用不同pH值的緩沖液 樣品膠 大孔徑 pH6 7 6 8Tris HCl緩沖液濃縮膠 與樣品膠相同分離膠 小孔徑 pH8 8 8 9Tris HCl緩沖液 樣品壓縮成層原理 電極緩沖液 pH8 3Tris 甘氨酸HCl 解離 Cl Cl 泳動(dòng)速度最快 快離子 CH2 NH2 COOH 樣品膠 濃縮膠pH6 7 6 8 CH2 NH2 COO 0 1 1 0 泳動(dòng)速度最慢 慢離子 蛋白質(zhì) P 泳動(dòng)速度介于快慢離子之間電泳時(shí) Cl 超過P走在最前面 其后形成一個(gè)離子濃度較低的低電導(dǎo)區(qū) 較高電位梯度 P和慢離子加速移動(dòng) P壓縮成層樣品進(jìn)入分離膠后 pH為9 5 電泳過程實(shí)測 CH2 NH2 COO 增加 泳動(dòng)速度增大 很快超過P P在均一的電位梯度和pH條件下分離 SDS 凝膠電泳原理 聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS P電泳遷移率取決于其分子量 而與形狀及所帶電荷無關(guān) 加入SDS和巰基乙醇后 巰基乙醇使P二硫鍵還原 SDS使氫鍵 疏水鍵打開 并結(jié)合到P分子上 形成P SDS 帶上相同密度負(fù)電荷 形狀為長橢圓形 短軸一定 長軸長度正比于P分子量 分離測定 測分子量 與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比較 鑒定樣品純度 條帶數(shù)目 測定樣品P含量 掃描定量 比色 凝膠電泳的操作要點(diǎn) 1凝膠制備2電極緩沖液3樣品處理及加樣4電泳5染色與固定6脫色7分析 煙曲霉菌中抗真菌活性肽類物質(zhì)的分離與純化 六等電點(diǎn)聚焦電泳 電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體 當(dāng)通已直流電時(shí) 兩性電解質(zhì)載體即形成一個(gè)由陽極到陰極連續(xù)增高的pH梯度 P進(jìn)入時(shí) 不同的P移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上 從而使不同等電點(diǎn)的P得以分離 優(yōu)點(diǎn) 分辨率高 區(qū)帶清晰 窄 加樣部位自由 重現(xiàn)性好 可測定P或多肽的等電點(diǎn) 缺點(diǎn) 需無鹽溶液 不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的P 1穩(wěn)定的pH梯度的形成2兩性電解質(zhì)載體要求 由多乙烯多胺與丙烯酸加成制備 有不同pH范圍的商品兩性電解質(zhì)載體 3支持pH梯度的介質(zhì)密度梯度溶液 用于自由電泳 凝膠 如聚丙烯酰胺凝膠 4操作要點(diǎn)pH梯度支持介質(zhì)的制備聚焦電泳檢測兩性電解質(zhì)載體的除去 電泳技術(shù)思考題 1名詞解釋電泳 電泳分離技術(shù) 泳動(dòng)度 電滲 區(qū)帶電泳 相對(duì)遷移率 不連續(xù)凝膠