2無菌檢查法.doc

文件名稱：無菌檢查法文件編號：SOP-QC255-00第 10 頁 共 10 頁1. 目的 建立無菌檢查法檢驗標準操作規(guī)程，規(guī)范操作。2. 范圍 適用于無菌檢查法。3. 依據(jù) 中華人民共和國藥典2010 年版二部附錄P103-107。4. 職責4.1 起草：QC 審核：QA 批準人：質量負責人4.2 QC 實施本規(guī)程。4.3 QA 監(jiān)督本規(guī)程的實施。5. 內容5.1 概述5.1.1 無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。5.1.2 無菌檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內或隔離系統(tǒng)中進行，其全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證。隔離系統(tǒng)按相關的要求進行驗證，其內部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進行監(jiān)控。5.1.3 無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經過無菌技術的培訓。5.2 儀器、設備和用具5.2.1 無菌室分無菌操作間和緩沖間，在緩沖間內應有洗臉手盆、毛巾、無菌衣放置架或鉤、拖鞋等，無菌室應具有空氣除菌過濾的層裝置，局部潔凈度100級或放置同等級別的超凈工作臺，室溫（1826）及除濕裝置，緩沖間及操作室內均設置能達到空氣消毒的紫外光燈及照明燈，操作室或工作臺應保持空氣正壓。5.2.1.1 無菌室應每周和每次操作前用0.1%新潔爾滅或2%甲酚酞擦試操作臺及可能污染的死角，開動無菌空氣過濾器及紫外燈殺菌1小時，在每次操作完畢，同樣用2%甲酚酞或0.1%新潔爾滅擦試工作臺面，除去室內濕氣，用紫外燈殺菌半小時。5.2.1.2 無菌室的無菌程度檢查，無菌室在消毒處理后，無菌試驗前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù)取直徑90mm雙碟，在接種室內點燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將雙碟半開注入溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，制淺平板，在35-37預培48小時，證明無菌后將平板3個，以無菌方式帶入無菌操作間的潔凈區(qū)左、中、右各放一個，打開碟蓋和置平板在空氣中暴露30分鐘后，將碟蓋蓋好，置35-37培養(yǎng)48小時，取出檢查，3個平板上生長的菌落數(shù)相加總數(shù)不得過10個。5.2.1.3 無菌操作臺面或超凈工作臺，應定期檢測其潔凈度，應達到100級塵埃粒子5um的粒數(shù)不得超過3.5/升；空氣流量應控制在0.75-1.0m3/s，細菌菌落數(shù)平均1個，可根據(jù)無菌狀況定期置換過濾器。5.2.1.4 無菌室內應準備好盛有消毒用5%甲酚酞的玻璃罐，酒精燈，火柴，鑷子75%酒精棉球，碘精棉及拖鞋等。5.2.2 真空泵極限壓力610-2Pa，抽數(shù)1L/S，轉速1400r/min,功率為0.25KW。置無菌室外，以耐壓橡皮管通入無菌操作室。5.2.3 恒溫培養(yǎng)箱及可調的30-35生化培養(yǎng)箱。5.2.4 離心機，顯微鏡、高壓滅菌爐、恒溫烤箱。5.2.5 玻璃器皿，試管移液管，刻度吸管（1.5ml、10ml）、注射器（2.5ml、10ml）雙碟等，用玻璃洗滌劑或清潔液浸泡，水洗3次，使用過后如與細菌接觸，應先滅菌后倒出內容物，再清洗、晾干，凡無菌操作過程中所用的器皿都應用牛皮紙包扎嚴密121滅菌30分鐘。5.2.5.1 移液管，刻度吸管在管口上端，松松塞上少許棉花，然后放入吸管簡內或牛皮紙袋內，消毒備用。5.2.5.2 試管、離心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上角棉膠專用塞或紗布棉塞，塞子應塞進管口內2/3處，用牛皮紙將管口包扎嚴，消毒備用。5.2.5.3 注射器、針頭（9、11、12號），將注射器與針頭配對，將注射器、針頭、管分別放在雙層紗布內扎嚴，消毒備用。5.2.6 無菌衣、褲帽、口罩等洗凈晾干，配套用牛皮紙包嚴，消毒備用。5.2.7 微孔濾膜，直徑50mm，孔徑0.45mm。5.2.8 除菌濾器目前多采用STV2型無菌檢查薄膜濾器裝置，它是由除菌過濾器和底座排液管，兩部分組成，新購置的濾器用毛刷將該裝置各部件用水刷凈，除去附著上的垢物，用水沖洗數(shù)次，純化水沖洗2次，玻璃筒放于清潔液中，再用水及純化水沖洗凈晾干備用。5.2.8.1 除菌濾器的裝配將過濾器的漏斗的上面置1個橡皮圈，上面加多孔墊板，在墊板上墊一個四氯乙烯膜墊圈，放上己浸濕的微孔膜片，在其上再墊一個四氯乙稀薄膜墊圈。按裝玻璃筒，套上金屬固定架，擰上底部圓螺母，漏斗底部大套上橡皮塞。將除菌濾器放于鋁板盒中，蓋嚴，外面用牛皮紙包扎滅菌備用。5.2.9 底座排液的排液管口接一條耐壓橡皮管并將管口用紗布、牛皮紙包扎，滅菌備用。5.2.10 手術鑷、手術剪洗凈，擦干，用雙層紗布將1把剪子與1個鑷子間隔包扎在一起放于鋁鈑盒內蓋嚴，用牛皮紙包扎滅菌備用。5.2.11 抽氣瓶為1000-2000ml，用水及純化水洗凈晾干，瓶口用配有兩個玻璃管（一個速至瓶底，一個短些）的橡皮塞蓋緊，短的玻璃管套上一個短耐壓橡皮管抽氣口用耐壓橡皮管與空氣過濾玻璃器（內充填以棉花）相連，空氣過濾玻璃器的另一管口用紗布、牛皮紙包扎嚴緊，抽氣瓶的全部裝置，用牛皮紙包扎，滅菌備用。5.2.12 用具的滅菌將包扎妥的用具，在（1210.5）蒸氣滅菌30分鐘，物品取出時切勿立即置冷處，適于高壓滅菌的器皿也可采用160干熱滅菌2小時。5.3 培養(yǎng)基 需氣菌、厭氣菌、真菌培養(yǎng)基按中國藥典規(guī)定。5.4 培養(yǎng)基靈敏度檢查，按中國藥典規(guī)定。5.5 對照用菌液的制備5.5.1 金黃色葡萄球菌液 取金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003的營養(yǎng)瓊脂，斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內，在30-35培養(yǎng)16-18小時后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成1：106。5.5.2 生孢梭菌菌液取生孢梭菌CMCC（B）64941的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物少許，接種至相同培養(yǎng)基內，在30-35培養(yǎng)18-24小時后，用滅菌生理鹽水稀釋成1：106。5.5.3 白色念珠菌菌液取白色念珠菌CMCC（B）98001的真菌瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物少許，接種至真菌培養(yǎng)基內在23-28培養(yǎng)24小時，用滅菌生理鹽水稀釋成1：105。5.6 檢查法的操作5.6.1 取備好的供試品，培養(yǎng)基在移入緩沖間之前應先編號，并用0.1%新潔爾滅或酒精棉擦試瓶（管）外壁，然后連同其他用具移入緩沖間，打開無菌間紫外光燈和空氣過濾裝置開關，并使其工作在1小時以上。5.6.2 操作人員用肥皂水清洗雙手，關閉紫外燈進入緩沖間，用碘酒棉，酒精棉擦手，穿戴衣帽口罩，將全部物品剝去牛皮紙移入滅菌室。5.7 培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基可按以下處方制備，也可使用按該處方生產的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應保存在2-25、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器，一般在3周內使用；若保存于密閉容器中，一般可在1年內使用。5.7.1 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的配制 稱取29.25g，加水1000ml加熱煮沸使溶解，分裝于試管中，（50ml/管）其裝量與容器高度的比例應符合培養(yǎng)基結束后培養(yǎng)層氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則，須經100水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘),迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置3035培養(yǎng)。5.7.2 改良馬丁培養(yǎng)基配制 稱取28.5g,加水1000ml加熱煮沸使溶解,分裝與試管中,(50ml/管)。改良馬丁培養(yǎng)基置2328培養(yǎng)。5.7.3 選擇性培養(yǎng)基按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法,在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法驗證試驗。5.8 培養(yǎng)基的適用性檢查5.8.1 無菌檢查用的硫乙醇鹽酸流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。5.8.2 無菌性檢查 每批培養(yǎng)基隨機取下不少于5支(瓶),培養(yǎng)14天,應無菌生長。5.9 靈敏度檢查菌種 培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代),并采用適宜的菌種保藏技術,以保證實驗菌株的生物學特性。 金黃色葡萄球菌 (Staphy lococcus aureus）CMCC(B)26 003 銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10 104 枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis)CMCC(B)63 501 生孢梭菌（Clostridium sporogenes)CMCC(B)64 941 白色念珠菌（Candida albicans)CMCC(F)98 001 黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)98 0035.10 菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、 枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，2328培養(yǎng)2448小時，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2328培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨醇80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。5.11 菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在28，可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗證過的貯存期內使用。5.12 培養(yǎng)基接種 取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結果。5.13 結果判斷空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。5.14 稀釋液、沖洗液及其制備方法稀釋液、沖洗液配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。5.14.1 0.1%蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，調節(jié)PH值至7.10.2，分裝，滅菌。5.14.2 PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液：取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。5.14.3根據(jù)供試品的特性，可選用其他經驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。5.15 方法驗證試驗當建立產品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該產品的無菌檢查。若該產品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變時，檢查方法應重新驗證。驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。5.16 菌種及菌液制備除大腸埃希菌（Escherichia coli）CM-CC(B)44 102外，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。5.17 薄膜過濾法取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或將培養(yǎng)基加至濾筒內。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)35天。各試驗菌同法操作。5.18 直接接種法 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天。5.19 結果判斷與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應采用增加沖洗量、增加配養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證試驗。5.20 供試品的無菌檢查5.20.1 檢查數(shù)量檢查數(shù)量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產品按表1規(guī)定；上市產品監(jiān)督檢驗按表2、表3規(guī)定。表1、表2、表3中最少檢驗數(shù)量不包括陽性對照試驗的供試品用量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應增加1/2的最小檢驗數(shù)量作陽性對照用；若采用直接接種法，應增加供試品無菌檢查時每個培養(yǎng)基容器接種的樣品量作陽性對照用。5.20.2 檢驗量 是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按表2、表3規(guī)定。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗量應不少于直接接種法的供試品總接種量，只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部內容物過濾。5.20.3 陽性對照應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌，陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)4872小時應生長良好。5.20.4 陰性對照供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物無毒性。5.20.5 無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。操作時，用適宜的消毒液對供試品容器表面進行徹底消毒。如果容器內有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭），向容器內導入無菌空氣，再按無菌操作啟開容器取出內容物。5.20.6 供試品處理及接種培養(yǎng)基除另有規(guī)定外，按下列方法進行。5.20.6.1 薄膜過濾法 薄膜過濾法應優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器，也可使用一般薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于0.45um，直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質?？股毓┰嚻窇x擇低吸附的濾器及濾膜。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。 水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml，且總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。5.20.6.2 水溶液供試品取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)一般不少于3次。所用的沖洗量、沖洗方法同方法驗證試驗，沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應的濾筒內。如采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其分成3等份，分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中一份作陽性對照用。5.20.6.3 可溶于水的