真核生物基因表達(dá)調(diào)控.ppt

EukaryoticGeneExpressionandRegulation 第八章 真核基因表達(dá)調(diào)控 本章主要內(nèi)容基因表達(dá)與調(diào)控的基本概念與原理轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控 transcriptionalregulation DNAlevel Genetic Chromatinlevel Epigenetic 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控 post transcriptionalregulation RNAinterference RNAi Proteindegradation Ubiquitin proteasome 第一節(jié)基本概念與原理 BasicConceptsandPrinciples Genome cell srepertoireofDNA Transcriptome cell srepertoireofRNAtranscripts Proteome cell srepertoireofproteins 單個(gè)基因 單個(gè)細(xì)胞 中心法則 一 基因表達(dá)的概念 基因組 genome 一個(gè)細(xì)胞或病毒所攜帶的全部遺傳信息或整套基因 基因表達(dá) geneexpression 基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄 翻譯 產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子或RNA分子的過(guò)程 基因表達(dá)調(diào)控 generegulation orregulationofgeneexpression 基因表達(dá)是受內(nèi)源及外源信號(hào)調(diào)控的 RegulationofGeneExpression RNAsilencing Proteindegradation 一般而言的基因表達(dá)調(diào)控范疇 二 基因表達(dá)的時(shí)間性及空間性 一 時(shí)間特異性 人體發(fā)育過(guò)程中不同類型 珠蛋白的含量變化 二 空間特異性 基因表達(dá)伴隨時(shí)間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異 實(shí)際上是由細(xì)胞在器官的分布決定的 所以空間特異性又稱細(xì)胞或組織特異性 cellortissuespecificity 在個(gè)體生長(zhǎng)全過(guò)程 某種基因產(chǎn)物在個(gè)體按不同組織空間順序出現(xiàn) 稱之為基因表達(dá)的空間特異性 spatialspecificity BARD1isexpressedspecificallyintheapicaldomainsofArabidopsisinflorescence A ovules B anthers C andembryos D InsuithybridizationA B C D antisenseBARD1probe E senseBARD1probeasanegativecontrol 朱玉賢第五章課件 四種母源影響基因的mRNA和蛋白沿果蠅胚胎前 后軸分布的濃度變化圖 protein BICOID NANOS 第十章 基因和發(fā)育 mRNA Facts Identicalgenome VirtuallyeverycellinanorganismcontainsacompletesetofgenesSpatialspecificity ButtheyarenotallturnedonineverycellortissueTemporalspecificity EachcellofanorganismexpressesadistinctivesubsetofgenesatdifferenttimeordevelopmentalstageTightregulation Duringdevelopmentdifferentcellsexpressdifferentsetsofgenesinapreciselyregulatedfashion 三 基因表達(dá)的方式 按對(duì)刺激的反應(yīng)性 基因表達(dá)的方式分為 一 組成性表達(dá) constitutiveexpression 某些基因在一個(gè)個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá) 通常被稱為管家基因 housekeepinggene 這類基因表達(dá)又稱為組成性基因表達(dá) constitutivegeneexpression genesforessentialcellularstructuresandmetabolicpathways e g rRNA actin tubulin usuallyexpressedathighleveltheleveloftheirgeneexpressionmayvary Housekeepinggenes rRNA actin tubulinarecommonlyusedasloadingcontrolinRT PCRorNorthernblot 二 誘導(dǎo)和阻遏表達(dá) 在特定環(huán)境信號(hào)刺激下 相應(yīng)的基因被激活 基因表達(dá)產(chǎn)物增加 這種基因稱為可誘導(dǎo)基因 induciblegenes 如果基因?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答是被抑制 這種基因是可阻遏基因 repressiblegenes 基因表達(dá)調(diào)控大多數(shù)是對(duì)這些基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯速率的調(diào)節(jié) 從而導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物的水平發(fā)生改變 影響其功能 四 基因表達(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義 一 維持細(xì)胞增殖 分化 二 維持個(gè)體生長(zhǎng) 發(fā)育 三 適應(yīng)環(huán)境變化 第九 十章 基因與疾病 基因與發(fā)育 將要講到 1 Transcripts 轉(zhuǎn)錄本 beginandendbeyondthecodingregion 5 UTRand3 UTR 2 Theprimarytranscriptisprocessedby 5 capping3 formation polyAsplicing 3 Maturetranscriptsaretransportedtothecytoplasmfortranslation 一般而言 基因表達(dá)調(diào)控主要是發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié) 即 mRNA合成的多少 transcription 五 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基本要素 一 RNA聚合酶 RNAPolymerase 二 特異DNA序列 cis actingelements 三 調(diào)節(jié)蛋白 trans actingfactors GeneexpressionregulationatthelevelofDNA transcriptionalregulation highlysequence dependent variedregulationfordifferentgenes cis actingelements promoters regulatorysequencesofgenestrans actingfactors proteinsandRNAsthatbindcis elementsandpromoteorrepressgeneexpression 一 RNA聚合酶啟動(dòng)子 調(diào)節(jié)序列和調(diào)節(jié)蛋白通過(guò)DNA 蛋白質(zhì)相互作用 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用影響RNA聚合酶活性 RNAPolI rRNA 相對(duì)活性50 70 RNAPolII mRNA 相對(duì)活性20 40 RNAPolIII tRNA 相對(duì)活性10 RNAPolIV smallncRNA 相對(duì)活性 真核生物基因組中含有可以調(diào)控自身基因表達(dá)活性的特異DNA序列 稱為順式作用元件 cis actingelement 順式作用元件能夠被轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白特異識(shí)別和結(jié)合 從而影響基因表達(dá)活性 啟動(dòng)子 promoter 順式作用元件又分增強(qiáng)子 enhancer 沉默子 silencer 二 特異DNA序列 反式作用因子 trans actingfactor 能直接或間接與順式作用元件相互作用 進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白 統(tǒng)稱為反式作用因子 按其功能不同 常有以下三類 基本轉(zhuǎn)錄因子 識(shí)別promoter元件轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 識(shí)別enhancer或silencer共調(diào)節(jié)因子 不能進(jìn)行DNA 蛋白質(zhì)相互作用 三 真核基因的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)蛋白 RNA聚合酶 在轉(zhuǎn)錄因子幫助下 形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 holoenzyme 1 基本轉(zhuǎn)錄因子 generaltranscriptionfactor GTF 是指能夠直接或間接與啟動(dòng)子核心序列TATA盒特異結(jié)合 并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一類調(diào)節(jié)蛋白 TBP TATA boxbindingprotein TFII polIIassociatedTF 2 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 transcriptionfactor TF 這類調(diào)節(jié)蛋白能識(shí)別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游序列和遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子元件 通過(guò)DNA 蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性 決定不同基因的時(shí)間 空間特異性表達(dá) 轉(zhuǎn)錄激活因子 transcriptionalactivator 轉(zhuǎn)錄阻遏因子 transcriptionalrepressor 3 共調(diào)節(jié)因子 transcriptionalregulator co factor 首先與轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生蛋白 蛋白相互作用 進(jìn)而影響它們的分子構(gòu)象 以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性 本身無(wú)DNA結(jié)合活性 如果與轉(zhuǎn)錄激活因子有協(xié)同作用 共激活因子 與轉(zhuǎn)錄阻遏因子有協(xié)同作用 共阻遏因子 常見(jiàn)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域 domain DNA結(jié)合域 DNAbindingdomain BasicAA K R rich positivelycharged 轉(zhuǎn)錄激活域 trans activationdomain TF ZincFinger bHLH bZIP Homeodomain 1 TF最常見(jiàn)的DNAbindingdomain 1 鋅指 zincfinger 常結(jié)合GCbox Cys X2 4 Cys X3 Phe X5 Leu X2 His X3 His C terminal helix bindingDNA 2 堿性亮氨酸拉鏈bZIP bHLH蛋白 basicHelix Loop Helix 3 堿性螺旋 環(huán) 螺旋bHLH 2 TF常見(jiàn)的trans activationdomain Activationdomainisinterchangeable InteractionAssaysDesignofTwo hybrid Three hybrid etc separablefunctionaldomains Two hybridassay protein protein Tri hybridassay protein RNA 1 RNApolymeraseII2 promoterandenhancers3 transcriptionfactors Eukaryoticgeneexpressionisusuallycontrolledatthelevelofinitiationoftranscription 真核基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控 Holoenzyme asupramolecularcomplexcomprisingPolII mostGTFs andMediator SrbcomplexInyeast a2MDaholoenzyme TBPsufficesfortranscription OrderedAssemblyandPolIIHoloenzyme TFIID TFIID one step multiple step TFIIBbindstoDNAandcontactsRNApolymeraseneartheRNAexitsiteandattheactivecenter andorientsitonDNA 25bp Q prok 10bpvseuk 25bp SequentialAssembly TBP TATAbindingproteinTAFs TBPassociatedfactors BindingofTFIID TBP 11TAFs 800KD totheTATAboxisthefirststepininitiation CTD RNAPolIIC terminaldomain CTDisanunusualextensionappendedtotheCterminusofthelargestsubunitofRNApolymeraseII Itcomprisesfrom25to52tandemcopiesoftheconsensusrepeatheptadY1S2P3T4S5P6S7 S2andS5aremajorphosphorylationsites CTDphosphorylationcausetheconversionofprolineisomerizationstates PhosphorylationpatternsontheCTDrepeatsdeterminedifferentsetsofassociatedfactors sothatprovideadynamicplatformtorecruitdifferentregulatorsofthetranscriptionapparatus Ineukaryoticcells thetranscriptionofgenesisaccuratelyorchestratedbothspatiallyandtemporallybytheC terminaldomainofRNApolymeraseII CTD PIC PhosphoS5isrequiredforassemblyofthePICandfacilitatesmRNAcappingviarecruitmentofcappingenzymes Elongation S5graduallybecomesdephosphorylated whereasS2isphosphorylated Terminating PhosphoS2ensuresefficient3 RNAprocessingbytriggeringrecruitmentof3 RNAprocessingmachinery Ending CTDsarefreeofphosphategroups non phosphorylatedCTDsarerequiredforRNApolymeraseIItorecycleandbindapromoterforthenextcycleoftranscription S2 S5 thetriggerfortranscriptionalprocessmodulation FactorsinvolvedingeneexpressionincludeRNApolymeraseandthebasalapparatus activatorsthatbinddirectlyto co activatorsthatbindtobothactivatorsandthebasalapparatus andregulatorsthatactonchromatinstructure chromatinremodelingcomplex ManyTranscriptionalActivators i e CAATGC box Neartheinitiationsite Alittlefaraway SP1stimulatestranscriptioninpresenceofTAFII110 GCboxesboundbyDNAbindingproteinSP1SP1recruitsTFIIDbybindingTAFII110Partiallyreconstitutedcomplex TBPand3TAFs inadditiontootherGTFs PolIIleadstohighlevelsoftranscription SV40earlypromoter Near Mediatorcomplexistargetedbyanactivator Mediatorisastablecomplexcontainingseveralproteins 20 50 MediatorbindstotheRNApolIIandtranscriptionfactors activatorsorrepressors and mediates theregulatorysignalstopolII 中介復(fù)合體 Far Whatisthemechanismofactivation Twomodels Tetheringholoenzyme recruitment Activatingholoenzyme allosteric Infavorofrecruitmentmodel 勾引模型 tatproteinofHIVcanstimulatetranscriptioninitiationwithoutbindingDNAatallTheactivatingdomainofthetatproteincanstimulatetranscriptionifitistetheredinthevicinityofpromoterbybindingtotheRNAproduct tarsequence ofapreviousroundoftranscription tar tat DNA bindingdomainistobringtheactivationdomainintothevicinityofthestartpoint Andactivationisindependentofthemeansoftethering wecanthinkofDNA binding orRNA bindinginthecaseoftat domainasprovidinga tethering function whosemainpurposeistoensurethattheactivationdomainisinthevicinityoftheinitiationcomplex Thenotionoftetheringisamoregeneralideathatinitiationrequiresahighconcentrationoftranscriptionfactorsinthevicinityofthepromoter Thismaybeachievedwhenactivatorsbindtoenhancers upstreampromoterelements orinanextremecasebytetheringtoanewly madeRNAproduct 總結(jié)所有激活因子的共性 識(shí)別靶位點(diǎn) 啟動(dòng)子 增強(qiáng)子 的特異性由DNA結(jié)合域決定 DNA結(jié)合域?qū)⑥D(zhuǎn)錄激活域帶到基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄區(qū)域附近 直接作用的激活因子具有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域 沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活域的激活因子可能與具有轉(zhuǎn)錄激活域的共激活因子一起行使功能 基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄區(qū)域中許多元件是 共 激活因子的靶位點(diǎn)RNA聚合酶可以和多種不同的轉(zhuǎn)錄因子相互作用 形成全酶復(fù)合物行使功能 Synergy Highlevelsoftranscriptioninducedbymultiplefactors Transcriptionfactorscanenhancetranscriptioninanon linearmannerSynergisiticactivationoccursduetomultiplecontactswiththemachineryMultiplecopiesofthesameactivatoralsoinducesynergisticactivation Interferon enhancer EnhancersoftenhavebindingsitesforseveraltranscriptionfactorsTranscriptionfactorscanbindcooperativelyatadjacentsitesArchitecturalfactors withnoregulatorydomains i e HMG1 canassistassemblyRemarkablyincreasebindingaffinityforbothDNAandmachinery HMG1 肩并肩 手挽手 根基穩(wěn) 魅力足 香肩并立 玉指緊扣 腳如磐石 面若桃花 Onepossiblestrategy Looping Cohesinshelptostabilizeenhancer promoterinteractions Howdoenhancersactindependentofdistanceandorientation Anenhancermayfunctionbybringingproteinsintothevicinityofthepromoter AnenhancerdoesnotactonapromoterattheoppositeendofalonglinearDNA butbecomeseffectivewhentheDNAisjoinedintoacirclebyaproteinbridge AnenhancerandpromoteronseparatecircularDNAsdonotinteract butcaninteractwhenthetwomoleculesarecatenated Twoexperimentssupporttheloopingmodel Theessentialroleoftheenhanceristoincreasetheconcentrationofactivatorinthevicinityofthepromoter Receptorsformanysteroidandthyroidhormoneshaveasimilarorganization withanindividualN terminalregion conservedDNA bindingregion andaC terminalhormone bindingregion Steroidreceptorsaretranscriptionfactors ZincfingerTF Glucocorticoidsregulategenetranscriptionbycausingtheirreceptortotransportintothenucleusandbindtoanenhancerwhoseactionisneededforpromoterfunction ActivationofGlucocorticoidReceptor GR Nuclearshuttling 利用GR的特性構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白系統(tǒng) Dexamethasone DEX 地塞米松 氟美松 抗炎藥 合成的一種糖皮質(zhì)激素 通過(guò)分子克隆的方法將GR和要研究的核蛋白X構(gòu)建成融合蛋白 轉(zhuǎn)基因到酵母 動(dòng)物細(xì)胞或者植物中 不施加外源DEX時(shí) 融合蛋白與HSP90形成復(fù)合物 由于構(gòu)象和空間位阻等原因 融合蛋白存在于胞質(zhì)中 不能定位到細(xì)胞核 添加DEX時(shí) DEX擴(kuò)散入胞與GR相結(jié)合 融合蛋白改變構(gòu)象后核定位信號(hào)暴露 即可入核行使功能 用以研究核蛋白的功能 包括轉(zhuǎn)錄因子 ActivationTaggingapproachinplants Planttransformation mutantsscreeninglocateT DNAinsertionsiteinArabidopsisgenome how identifytherightgeneconferringmutantphenotype how 構(gòu)建T DNA序列 其中包括4倍重復(fù)的CaMV的35S增強(qiáng)字序列 4 35S元件可以大大增強(qiáng)相鄰基因的轉(zhuǎn)錄 通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法將T DNA片段整合到植物基因組中 植物基因組上與T DNA插入位點(diǎn)相近的基因表達(dá)量增高 即得到這個(gè)基因gain of function的轉(zhuǎn)基因植物 XVE LexA的DNA結(jié)合域 X VP16轉(zhuǎn)錄激活域 V humanestrogenreceptor調(diào)控域 E NPTII 轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記OLexA 46 LexA操縱子 CaMV35S基本啟動(dòng)子 而非增強(qiáng)子 Achemical inducibleactivationtaggingvectorpER16inplants RB LB T DNAfragment 可以插入到基因組中 其工作原理為 在G10 90啟動(dòng)子控制下 XVE融合轉(zhuǎn)錄因子組成型表達(dá) 當(dāng)加入雌激素 雌激素和受體調(diào)控域 E 結(jié)合 導(dǎo)致XVE融合蛋白構(gòu)象發(fā)生變化 并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入核內(nèi) 在細(xì)胞核內(nèi) XVE中的LexADNA結(jié)合域 X 特異識(shí)別LexA操縱子區(qū) OLexA VP16的轉(zhuǎn)錄激活域 V 激活LB旁邊的基因高水平表達(dá) EnhancerTrap Enhancertrap的質(zhì)粒包含一個(gè)報(bào)告基因 lacZ 和基本啟動(dòng)子 這段啟動(dòng)子不足以啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá) 但是對(duì)增強(qiáng)子非常敏感 將這樣的