（分析化學(xué)專(zhuān)業(yè)論文）用于細(xì)胞內(nèi)自由基及生物活性分子研究的新型熒光探針的研究與應(yīng)用.pdf

獨(dú)創(chuàng)聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的 研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其 他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得( 注：如 沒(méi)有其他需要特別聲明的，本欄可空) 或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)使用過(guò)的材 料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明 并表示謝意。 學(xué)位論文作者簽名：罩辛牝疵 導(dǎo)師簽字： 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū) ) 劾l 0 i 本學(xué)位論文作者完全了解堂撞有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保 留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。 本人授權(quán)堂撞可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可 以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。( 保密的學(xué)位論文在 解密后適用本授權(quán)書(shū)) 、 導(dǎo)師簽字：、節(jié)h 式 簽字日期：2 0 0 擴(kuò)年，月培同 、比 毒 日p 伯晉形 輒 一月 簽 者 年 作伊0 史 論 以 位 期 學(xué) 日 字 簽 山東師范大學(xué)碩士論文 摘要 在生物體生命活動(dòng)的新陳代謝過(guò)程中會(huì)不斷產(chǎn)生各種自由基，超氧陰離子自 由基( 0 2 ) 、羥基自由基( h o ) 、脂自由基限o o ) 、一氧化氮( n o ) 、過(guò)氧亞 硝基陰離子( o n o o 。) 是生命活動(dòng)過(guò)程中具有代表性的重要自由基，它們與生物體 的衰老及許多疾病的發(fā)生都有重要關(guān)系。生物體中適當(dāng)水平的活性氧是機(jī)體維持 良好免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，而活性氧自由基大量存在時(shí)則是有害的。從目前研究結(jié)果 揭示的證據(jù)表明，氧自由基幾乎和人類(lèi)大部分常見(jiàn)的幾種主要疾病如心臟病、癌 癥、惡性腫瘤等都有關(guān)系。目前已經(jīng)建立的測(cè)定自由基的方法有很多種，其中熒 光法靈敏度高，選擇性好，檢測(cè)限低，用于自由基的測(cè)定具有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此， 近年來(lái)對(duì)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的熒光探針的研究發(fā)展迅速。 。 在生物體中，各種生物活性分子是細(xì)胞、組織和器官不可缺少的組成部分， 并且參與細(xì)胞增殖與分化、生命遺傳、細(xì)胞新陳代謝等活動(dòng)。因此，在生命科學(xué) 的研究中，對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、肽等生物活性分子的研究占有重要的地位。近年來(lái) 對(duì)檢測(cè)細(xì)胞中生物活性分子的研究越來(lái)越多，熒光法不僅簡(jiǎn)單易行，便于操作， 具有高靈敏度、高選擇性的特點(diǎn)，更加吸引人的是探針?lè)肿涌梢栽诓黄茐纳锘?性的情況下進(jìn)入細(xì)胞，與活細(xì)胞內(nèi)的生物活性分子等結(jié)合生成強(qiáng)熒光物質(zhì)，并借 助于激光共聚焦成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)待測(cè)活性分子的“可視化”，從而對(duì)他們?cè)?生命體內(nèi)進(jìn)行“實(shí)時(shí)在線”的檢測(cè)。近年來(lái)，生物成像在活細(xì)胞的生物分子檢測(cè)上 取得了巨大進(jìn)展，而熒光探針由于具有高靈敏度，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而也成為生物 成像最主要的工具。 本論文基于熒光探針與活性氧自由基或其它生物活性分子特異性作用后熒 光光譜性質(zhì)的改變從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定物質(zhì)的檢測(cè)，并將所設(shè)計(jì)探針成功用于生物活 體細(xì)胞的共聚焦顯微成像。主要開(kāi)展了以下兩方面研究工作： ( 一) 基于谷胱甘肽過(guò)氧化物酶類(lèi)似物e b s e l e n 具有類(lèi)似谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 的催化活性，將與其含巰基物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)的硒氮鍵引入熒光染料，設(shè)計(jì)合 成一種以羅丹明6 g 為母體含有硒氮鍵的新型熒光探針用于識(shí)別巰基化合物?；?于巰基的親核作用機(jī)理將硒氮鍵打斷，從而恢復(fù)羅丹明6 g 的強(qiáng)熒光。實(shí)現(xiàn)了模 擬生物體系中探針光譜性質(zhì)的檢測(cè)，通過(guò)測(cè)定探針熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)了其對(duì)含 山東師范大學(xué)碩士論文 巰基類(lèi)物質(zhì)的識(shí)別。方法的線性范圍為3 0 1 0 一1 2 1 0 7 m ，檢測(cè)限為1 4 n m 。 h l 7 7 0 2 人正常肝細(xì)胞及h 印g 2 人肝癌細(xì)胞內(nèi)巰基類(lèi)物質(zhì)的熒光共聚焦成像實(shí) 驗(yàn)表明：探針具有膜穿透性，對(duì)兩種細(xì)胞內(nèi)巰基類(lèi)物質(zhì)的含量差異產(chǎn)生響應(yīng)，表 現(xiàn)了良好的生物適用性。 ( 二) 設(shè)計(jì)合成了檢測(cè)脂質(zhì)自由基的新型熒光探針熒光素?zé)晒馑亻g三氟甲基 苯亞硒酸酯，用兩種合成方法完成。產(chǎn)物用核磁氫譜、碳譜、硒譜，紅外，質(zhì)譜 等進(jìn)行表征。研究了探針與脂質(zhì)自由基的反應(yīng)機(jī)理，探針自身熒光相對(duì)較弱，在 有機(jī)溶劑體系中脂質(zhì)自由基與探針中的硒氧鍵發(fā)生特異性反應(yīng)并使探針恢復(fù)熒 光素的強(qiáng)熒光。研究了探針的性質(zhì)，其激發(fā)和發(fā)射分別位于5 1 5 5 3 5 衄，光穩(wěn)定性 較好。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示探針的光穩(wěn)定性較好，探針與枯烯氫過(guò)氧化物反應(yīng)可在2 0 幽之內(nèi)完成，且反應(yīng)完成后熒光強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定。探針與多種活性氧反應(yīng)結(jié) 果顯示探針對(duì)枯烯氫過(guò)氧化物的選擇性較好。最后將探針用于檢測(cè)博萊霉素致肺 纖維化大鼠胸腔灌洗液實(shí)際樣品中的脂質(zhì)自由基，結(jié)果顯示不同大鼠胸腔灌洗液 的熒光強(qiáng)度變化顯示了大鼠在正常、肺纖維化、用中藥和西藥治療后體內(nèi)活性氧 含量的變化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了探針檢測(cè)脂質(zhì)氫過(guò)氧化物有效性。 關(guān)鍵詞：含硒分子熒光探針活性氧巰基化合物脂質(zhì)自由基共聚焦顯 微成像 山東師范大學(xué)碩士論文 a b s t i a c t n 啪e r o u s 丘e e砌c a l sa r c g e n e r a t e di nt h ec o u r s eo fb i o l o g ym e t a ：b 0 1 i s m s u p e r o x i d ea 1 1 i o nr a d i c a l s ( 0 2 。) ，h y d r o x y lm d i c a l s ( h o ) ，r o o a n dn o a r es o i n e t y p i c a lo n e s t h e yh a v e 硫p o r t a n tr e l a t i o n 、析t l l 呼n ga n dm 缸yd i s e a s e s i t i s r 印o r t e dt h a t 印p r 0 研a t e1 e v e lo fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) c o u l dh e l pt ob u i l d b i 0 1 0 百c a l 幻：l i 】姍es y s t 鋤，w h i l ee x c e s sr o s h a v ed 鋤a g e so no 瑪a n i s m s r e c e l l t s t u d i e sd e m o n s 缸t e dt h a tr o sc 狃c a u s em a l l y 擊s e 嬲e ss u c h 鵲h e a r td i s e 器e ，c a n c m a l i 目a 1 1 c ya i l d o n t h e r ea r ea1 0 to fm e t l l o d sr 印o r t e dt od e t c c tr o s ，鋤o n g w m c h u s i n gn u o r e s c e n tp r o b e si s a 1 1i d e a lm e m o db e c a u s eo fi t so b 譏o l l sa d v 觚t a g e s h k el l i 曲s 咖i t i v i 劬g o o ds e l e c t i 訪t ya n d 1 0 wd e t e c t i o n t h 峪，咖d i e s0 nf l u o r e s c 饑t p r o b e sf o rd e t e c t i n gc e l l u l a ri 的sh a v eg r c a t l yd e v e l o p e d b e s i d e s ，v a d o u sb i o a c t i v em o l e c u l e sa r ei n d i s p e n sa ：b l ec o m p o n 饑to fo r g a l l i s m t h e ya l s 0t a l 【ep a r ti nv a r i o 璐1 i f ea c t i v i t i e s ，r h u s ，s t 嘣e s0 nb i o - a c t i v em 0 1 e c u l e s i n c l u 血瑁肌c l e i ca c i d ，p r o t e 氓p 印t i d e ，趾do l 盯b i o a c t i v ei i l 伊e d i e n t sp l a y 孤 i 1 1 1 p o n a n tr o l e 證l i f es c i e i ：l c e r e c e n ty e a r s ，n 1 0 r e 缸l dn 1 0 r es t l l m e sf o c u so nd e t e c t i l l g b i o - a c t i v en 1 0 l e c u l 髓a m o n g 也e s em e t h o d s ，u s i n gn u o r e s c e n tp r o b e sh 嬲m 觚y a d v 齟t a g e ss u c h 勰l l i 曲s e i l s i t i v i 劬h i 曲s e l e c t i v 時(shí)a n de 觴yt 00 p e m t e b e s i d e s ，w h a t i sm o r e 舭吐v ei st h a tn u o r e s c e n tp r o b e sc 觚p e 鵬位l ：t e 證t 0c e l l sw i 廿1 0 u t 舡l y d 鋤a g e ， a n dc o m b i r l ew i t hb i o a c t i v en 1 0 1 e c u l e st 0 f 0 皿s 仃0 1 1 9 1 yf l u o r e s c 肌t s u b s t a n c e w i t l l 也eh e l po fc o n f o c a l1 1 1 i c r o s c o p i ci i n a g m g ，譏s u a l i z i l l ga n dr e a l - t 血e d e t e c t i n go fb i o a c t i v em o l e c u l e sc a nb ea c l l i e v e d r e c e my e a r s ，i i n 畫(huà)n go fl i v i n g c e l l sb a sm a d eg r e a tp r 0 伊e s s ，a n dn u o r e s c e n tp r o b eh a sb e c o m em em o s t 曲p o r t 鋤 t 0 0 lb e c a u s eo fi t sa d v a n t a g e s b 硒e do n 廿l ec h a n g e si i ls p e c 譏m 1c h a r a c t e r so ft h ef l u o r e s c e n tp r o b e sr e a u c t i n g 塒t l l r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e so rb i o a c t i v em o l e c u l e s ，w eh a v ea c h i e v e d 也ed e t e c t i o no f t l l e s ei 1 1 乒e d i 觚t s t l l ed e s i g n e dn u o r e s c e mp r o b e sw e r ea l s 0 a p p l i e dt 0 c o 砌0 c a l i l i l a g i l l go fs e v e r a lk i l l d so fc e l l s 、c a 塒e do u tt w da s p e c t so fi 】w e s t i g 撕o n ： f i r s t ，b a s e do ne b s e l e n ，廿1 ew e nk n o w ni i 血1 e t i co fg p x ，w h i c h 麟血b i t si t s c a t a l y t i cg p xa c t i v i t y ，w ed e s i g n dt oi n 仃o d u c et h es e l c l l i u m - 1 1 i 仃0 9 e nb o n dw 1 1 i c h r e a c t sw i t ht h j o l st 0f h l o r e s c e n c ed y e s w ed e s i 印e d吼ds 皿h e s i z e dan o v e l r h o d 鋤i n e - b a s e dn u o r e s c tp r o b ec o n t a i l l i n gas e nb o n d 矗 d e t e c t i n gt m o l s d u e t ot l l es t r o n gn u c l e o p l l i l i c i t yo ft 1 1 es u l f l l 舛時(shí)l ，t 1 1 es e nb o n do ft h ep r o b ew 嬲c l e a v e d ， r e s u l t i n gi nt h ef o 衄a t i o no fm es 仃o n g l yf l u o r e s c e n td y er h o d 鋤i n e6 g t 1 1 es p e c t m l 山東師范大學(xué)碩士論文 p r o p e r t i e so ft 1 1 ep r o b ew e r et e s t e di i ls i m u l a t e dp h y s i o l o 百c a lc o n d i t i o n a r l dw e a c l l i e v e dm ed e t e c t i o no f 1 i 0 1 sb yd e t e c 血gt 1 1 en u o r e s c 肌c ec h a i l g e s t h e f l u o r e s c e l l c ei n c r e a u s ei sp r o p o r t i o n a lt 0t h ec o n c e n 仃a t i o no ft h j o li i lt 1 1 er a i l g eo f 3 0 1 0 9 1 2 1 0 7m t h el i m i to fd e t e c t i o ni s 1 4n m c o n f o c a l l i c r o s c o p i ci m 唾乒n g o fh l - 7 7 0 2a 1 1 dh 印( 記c e l l sr e v e a l st h a tt 1 1 ep r o b ei sc e l l - p e n n e a b l e 鋤di 1 1 臼陋c e l l u l a r l i o l r e s p o n s i v e s e c o n d ， w ed e s i 印e d 觚ds y l l 吐l i z e dan 0 v e ln u o r e s c e n t p r o b e3 ，3 b i s 衄丑u o r o m e t l l y l b 黜n e s d e l l i n 妒) 丑u o r e s c 豳內(nèi)r 卻i dp 鋤x i d eb yt 購(gòu)k i 礎(chǔ)o f s 州h e s i sm e t h o d t 1 1 ep r o d u c t sw e r ew e uc h a r a c t e r i z e db y 1h n m r1 3 cn m r 7 7 s e 珉瓜a n dm s t h er c a c t i o nm e c m s m0 fn u o r e s c 咖p r o b e 姐dh p i dp 啪x i d e w a ss m d i e d 王n c o 眥e r i n gi i p i dp e r o x i d ei l lo 瑪枷cs y s t e m ，m ew e a k l yf l u o r e s c e d p r o b es h o w e ds 仃d n gn u o r e s c e n tr e s p o n s ed u et 0t h er e a c t i o nb e 鉚e e nl i p i dp e i d e a n dt 1 1 es e l 朋i u m - o x y g e i lb o n do fm ep r o b e t h es p e c t r ap r o p e n i 鼯o f 1 ep r o b ew e r e s t u d i e da n dt h em a x i i i l 眥e x i t 撕0 na n de m 血s i o ni i e da t5 15 5 3 5i 皿陀s p e c t i v l y t h e k i i l e c t i cs c a ns h o w e dm eg o o d1 i g h ts t a b i l i 哆o f 血ep r o b ea n d l ep r o b ec o u l d c o m p l e t e l y 仃a pc 唧e n eh 、，d r o p e r o x i d ei n2 0m i l l t h es e l e c t i 夠o ft 1 1 ep r 0 b ew 勰 t e s t e da n dm er e s u ns h o w e d 協(xié)a tm ep r o b es h o w e dg o o ds e l e c t i v i 哆t o w a r dc u o o h m a no t h c rr o s f i i l a l l y ，t od e m o n s t i a t et h ep r a c t i c a b i l 毋o fm ep r o b e ，i tw a sa p p l i e d t 0d e t e c tt 1 1 el i p i dp e r o x i d eo fd i 蠡f 孤l tb n d so fr a t s 矗l c l u d i i l gn o 冊(cè)a 1o n e s ，r a t sw i m b l e o m y c i n - i n d u c e dp u l i l l o n a 巧丘b r o s i sa n do t l l e r sc u r e db yc l l i n e s e 仃a d i t i o n a jd m g s 觀dw e s t 鋤d m g s t h er e s u n ss h o w e dt 1 1 a td i f - f e r e n tf l u o r e s c e n tr c s p o n s e sw 盱e d e t e c t e di 1 1d i f f e r e n tk h l d so fr a t s w k c hw a si 1 1a c c o r d a n c ew i t l lt l l e i rv a d o u se x t e n t s o fl i p i dp e r o x i d a t i o n k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n tp r c i b ec o n t a i n i l l gs e l e i l i m n r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 。t h j o a 1 1 a 1 ”e s l i p i dp e r o x i d e 。c o n f o c a l1 1 1 i c r o s c o p i ci m a 百n g 。 4 山東師范大學(xué)碩士論文 第一章緒論 。 生物體是由各種不同的化學(xué)物質(zhì)組成的，這些物質(zhì)及其復(fù)雜的化學(xué)組成、結(jié) 構(gòu)及化學(xué)變化構(gòu)成了千姿百態(tài)的生命現(xiàn)象。隨著生物化學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展與 各種物理、化學(xué)、生物學(xué)的研究手段的應(yīng)用使生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程逐漸得到 闡明。在生物體中，各種生物活性物質(zhì)是細(xì)胞、組織和器官不可缺少的組成部分， 并且參與細(xì)胞增殖與分化、生命遺傳、細(xì)胞新陳代謝等活動(dòng)。因此，生命活動(dòng)是 許多具有生物活性的物質(zhì)參與的各種化學(xué)反應(yīng)的總結(jié)果。在生命科學(xué)的研究中， 對(duì)多種生物活性物質(zhì)包括自由基及核酸、蛋白質(zhì)、肽等生物活性分子的研究占有 重要的地位。 第一節(jié)自由基的生理和病理作用及其檢測(cè)技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)介 1 自由基的生理作用 近年來(lái)，自由基生物學(xué)的研究與發(fā)展極為迅速，已經(jīng)成為生命科學(xué)研究中 的一個(gè)新的亮點(diǎn)，許多研究表明，活性氧自由基在生物體衰老與疾病，以及正常 的免疫代謝與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中都起著重要的生理作用。因此，關(guān)于細(xì)胞體 內(nèi)( 尤其在關(guān)聯(lián)到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中) 活性氧自由基分子作用機(jī)制的研究備受關(guān)注。 在生命活動(dòng)的氧化代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生各種活性氧自由基，其中超氧陰離子自由 基( 0 2 ) 、羥基自由基( h o ) 、雙氧水( h 2 0 2 ) 、一氧化氮( n 0 ) 、脂自由基( r o o ) 、 過(guò)氧亞硝基陰離子( o n o o ) 是具有代表性的重要自由基。人體在應(yīng)激、炎癥等 生理、病理情況下可不斷的通過(guò)非酶反應(yīng)和酶促氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生各種活性氧 【l 】。生物體內(nèi)的自由基不斷的產(chǎn)生，也不斷的被清除，正常情況下自由基始終 被清除而維持在一個(gè)極低的平衡水平。自由基具有重要的生理作用：( 1 ) 活性氧 能提高吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的殺菌功能，當(dāng)吞噬細(xì)胞進(jìn)行吞噬作用時(shí)常與氧代 謝突然增長(zhǎng)聯(lián)系在一起，這一現(xiàn)象稱(chēng)為呼吸爆發(fā)( r e s p 婦。巧b 刪) 。氧代謝首 先產(chǎn)生大量的h 2 0 2 ，其次產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基，另外還產(chǎn)生一定量的羥 自由基和單線態(tài)氧。機(jī)體內(nèi)的葡萄糖提供了產(chǎn)生超氧陰離子自由基所需的能量， 而氧呼吸突發(fā)中產(chǎn)生的各類(lèi)活性氧中以h 2 0 2 的殺菌作用最強(qiáng)，并且其殺菌能力在 有鹵素離子及過(guò)氧化物酶存在時(shí)能增強(qiáng)數(shù)倍【2 1 ；( 2 ) 與人體中的一些激素、酶 及蛋白的合成有關(guān)，如參與前列腺素、凝血酶原和膠原蛋白的合成；( 3 ) 具有 山東師范大學(xué)碩士論文 解毒作用，機(jī)體對(duì)外來(lái)物質(zhì)的解毒作用主要在肝臟中進(jìn)行，有0 2 參加【2 1 ；( 4 ) 與 生殖和胚胎發(fā)育有判3 】；( 5 ) 在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化過(guò)程起重要作用，大量研究證 明，低濃度的活性氧如0 2 和h 2 0 2 可以促進(jìn)一系列正常或癌變細(xì)胞的生長(zhǎng)，是細(xì) 胞維持生存和生長(zhǎng)不可缺少的因子，缺少了它們，細(xì)胞將無(wú)法增殖，甚至?xí)劳?【4 刁】；( 6 ) 可調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，參與機(jī)體免疫和環(huán)核苷酸的生物合成。研究顯示n o 與機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)關(guān)系密切，在機(jī)體的免疫過(guò)程中發(fā)揮了重要作用【8 ，9 】。 而且n o 還是重要的細(xì)胞內(nèi)信使分子【1 0 j 。在正常生理情況下，生物體中適當(dāng)水平 的活性氧自由基可以維持機(jī)體良好的免疫應(yīng)答，而且它們參與了機(jī)體生理活動(dòng)的 某些有益環(huán)節(jié)，因此在正常的生命過(guò)程中，自由基具有重要的生理作用。 2 自由基的病理作用 盡管機(jī)體內(nèi)適當(dāng)水平的活性氧為維持生命所必需，但是活性氧自由基大量 存在時(shí)則是有害的，可對(duì)人體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、脂肪酸等生物大分子造成損害。 目前已探明，每日每個(gè)細(xì)胞的生物分子可受到1 0 4 - 1 0 5 次活性氧的攻擊而發(fā)生損 傷，從而對(duì)組織細(xì)胞的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞性修飾，損傷正常組織細(xì)胞的形態(tài)和功 能f 1 1 】，導(dǎo)致組織損傷或機(jī)體衰老。大量研究證明，自由基與生物體的衰老及許多 疾病的發(fā)生都有重要關(guān)系【1 2 】，又能導(dǎo)致組織細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子結(jié)構(gòu)的破壞，并 隨著破壞層次逐漸擴(kuò)展造成功能損傷，因此構(gòu)成很多疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。 醫(yī)學(xué)研究證明，氧自由基幾乎和人類(lèi)大部分常見(jiàn)的幾種主要疾病都有關(guān)系。 過(guò)量活性氧可引起腫瘤、心腦血管病、哮喘、肺氣腫、白內(nèi)障、潰瘍、老年性癡 呆、帕金森氏綜合癥、類(lèi)風(fēng)濕病、艾滋病等疾病，或加重這些疾病的病情，并可 加快人體衰老的過(guò)程【1 3 1 卯。心臟病是人類(lèi)死亡率最高的一種疾病。z w e i e r 等人提 出心肌缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生了氧自由基，半醌自由基和含氮自由基1 6 ，1 7 】。惡性腫瘤 即癌是人類(lèi)可怕的疾病，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康?；钚匝跸? s ) 增高是輻射 和化學(xué)致癌過(guò)程中，特別是癌變?cè)缙陔A段的共同特劇1 8 】。幾乎所有的致癌因素在 啟動(dòng)或促進(jìn)細(xì)胞癌變過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生大量的包括活性氧在內(nèi)的多種形式的自由 基。在腫瘤形成初期，自由基含量急速增加，當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到一定大小時(shí)，自由基 含量達(dá)到一個(gè)最大值，然后隨腫瘤的生長(zhǎng)自由基含量不僅不再增加，反而呈下降 趨勢(shì)，這表明自由基在腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程中起重要作用【l 引。關(guān)于愛(ài)滋病和自由 基的報(bào)道中指出愛(ài)滋病感染免疫系統(tǒng)的各個(gè)部分，最后導(dǎo)致進(jìn)行性的免疫缺陷。 自由基與愛(ài)滋病的關(guān)系可從兩個(gè)方面來(lái)看，一方面愛(ài)滋病細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基減 6 山東師范大學(xué)碩士論文 少，可能使免疫殺傷能力降低，愛(ài)滋病人容易感染各種疾?。涣硪环矫?，氧自由 基可以刺激愛(ài)滋病毒復(fù)制，導(dǎo)致病情加重。帕金森綜合癥是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng) 多巴胺能神經(jīng)元功能障礙為病因的神經(jīng)功能紊亂癥，近年研究表明自由基與這種 疾病的關(guān)系非常密切【2 0 1 。在神經(jīng)系統(tǒng)，早老性癡呆癥，震顫麻痹癥等疾病都有氧 自由基的參與；在循環(huán)系統(tǒng)，動(dòng)脈粥樣硬化，血栓的形成，心肌缺血再灌注損傷 的發(fā)病過(guò)程中氧自由基起著重要作用；肝炎和糖尿病與自由基密切相關(guān)；致癌、 促癌和癌的形成的每一步都有自由基的產(chǎn)生和參與；白內(nèi)障的形成和視網(wǎng)膜的損 傷是自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化的直接結(jié)果；在免疫反應(yīng)的炎癥中，巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā) 釋放大量氧自由基?？傊?，生物體內(nèi)過(guò)量自由基可導(dǎo)致對(duì)蛋白質(zhì)的損害，使蛋白 質(zhì)失去活性，還可導(dǎo)致對(duì)核酸的損害使d n a 的氧化損傷，引起衰老、癌癥等疾 病。自由基對(duì)細(xì)胞膜的損害主要是引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損害細(xì)胞膜的組分和結(jié) 構(gòu)【2 1 1 ，而且能介導(dǎo)細(xì)胞的調(diào)亡【2 2 2 4 1 ，從而引起機(jī)體衰老及腫瘤【2 5 】、癌癥和其它 對(duì)生命產(chǎn)生威脅的疾病。 3 自由基檢測(cè)技術(shù)發(fā)展概況 。 由于自由基存在著重要的生理及病理作用，而有關(guān)自由基的研究已經(jīng)涉及到 癌癥治療、心血管病防治、預(yù)防衰老和器官移植等臨床醫(yī)學(xué)的重大疑難問(wèn)題，這 也是植物生理與發(fā)育的關(guān)鍵問(wèn)題?；钚匝踝杂苫鶎?duì)生物體的損傷作用雖然已經(jīng)逐 步獲得公認(rèn)，在2 0 世紀(jì)受到了極大關(guān)注【2 6 】。然而，由于生物體內(nèi)活性氧自由基的 半衰期非常短，穩(wěn)態(tài)濃度極低，所以真正適用于檢測(cè)生物活體內(nèi)r o s 的方法還是 較少的，特別是在生物活體內(nèi)與直接原位的檢測(cè)。另外，生物體內(nèi)還存在著預(yù)防 自由基損傷的內(nèi)在抗氧化防護(hù)體系 2 7 1 ，因而至今為止對(duì)直接動(dòng)態(tài)觀測(cè)某些器官中 活性自由基的產(chǎn)生，對(duì)它們的生成機(jī)制，生理作用及其動(dòng)態(tài)損傷生物機(jī)體的過(guò)程 都缺乏足夠的認(rèn)識(shí)和充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，以至在臨床上直接影響和限制對(duì)許多疾病 的治療效果。目前，熒光法結(jié)合共聚焦顯微成像技術(shù)和微區(qū)光譜檢測(cè)技術(shù)，是唯 一能實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞和組織內(nèi)的r o s “實(shí)時(shí)、可視、定量”的檢測(cè)方法。這就迫切需 。- 要科研工作者開(kāi)發(fā)對(duì)r o s 能夠?qū)Ｒ蛔R(shí)別、快速響應(yīng)的熒光探針用以動(dòng)態(tài)觀測(cè)研 究某些器官中活性氧自由基的產(chǎn)生、代謝、相互轉(zhuǎn)化及其動(dòng)態(tài)損傷生物機(jī)體的過(guò) 程。因此，針對(duì)動(dòng)、植物生物活體內(nèi)自由基開(kāi)創(chuàng)新的分析與檢測(cè)技術(shù)是分析化學(xué) 學(xué)科發(fā)展中具有挑戰(zhàn)性的前沿課題之一。 目前已經(jīng)用于測(cè)定自由基的方法主要有電子r i 旋共振法( e s r ) ，或電子順 山東師范大學(xué)碩士論文 磁共振法( e p r ) 【2 引、高效液相色譜法( h p l c ) 【2 9 】、化學(xué)發(fā)光法( c l ) 【3 0 】、熒 光法【3 l 3 2 1 、電化學(xué)方法 3 3 。3 5 1 等。在上述方法中，熒光法不僅簡(jiǎn)單易行，便于操 作，具有高靈敏度、高選擇性的特點(diǎn)，更加吸引人的是探針?lè)肿涌梢栽诓黄茐纳?物活性的情況下進(jìn)入細(xì)胞，與活細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)物一活性氧結(jié)合生成強(qiáng)熒光物質(zhì)， 并通過(guò)借助于激光共聚焦成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)待測(cè)活性物質(zhì)的“可視化”，從 而對(duì)他們?cè)谏w內(nèi)進(jìn)行“實(shí)時(shí)在線”的檢測(cè)。近年來(lái)，用熒光探針實(shí)時(shí)檢測(cè)活 細(xì)胞內(nèi)氧自由基的研究取得了巨大進(jìn)展。2 0 0 4 年n o b u a l ( is o h 等人設(shè)計(jì)合成了基 于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)理( f i 也t ) 的一種新型熒光探針，羥基自由基引起的 d n a 鏈的斷裂，導(dǎo)致了f r e t 的“開(kāi)關(guān) 轉(zhuǎn)換，伴隨著熒光光譜的變化，從而 實(shí)現(xiàn)了對(duì)羥基自由基的定量檢測(cè)【3 6 】。( 圖1 ) “孫m 鼢：舅：t ，： 唾酣t 艫，似d ? 瑚 ，o h 勰艚一仃二t l x 舯 _ 盈o 瓣纛翟 圖l 探針?lè)磻?yīng)機(jī)理 2 0 0 4 年m i c h e l l e 等將熒光素的3 、6 位的羥基用片吶酮硼取代，合成了一種具 有高選擇性測(cè)定細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的光學(xué)探針p e r o x n u o r - l ( p f l ) ，探針自身不發(fā)熒 光，基于與過(guò)氧化氫結(jié)合發(fā)生羥基的去保護(hù)，從而產(chǎn)生熒光產(chǎn)物熒光素。將活細(xì) 胞樣品用p f l 誘導(dǎo)，加入過(guò)氧化氫可直接在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞的熒光成像， 證實(shí)了探針對(duì)過(guò)氧化氫的選擇性識(shí)別【37 1 。( 圖2 ) 奄韶落皿礤 弋玲丁、 地 圖2p f l 探針結(jié)構(gòu)及活細(xì)胞檢測(cè)h ! 0 2 的熒光成像 山東師范大學(xué)碩士論文 2 0 0 5 年h a t s u om a e d a 等學(xué)者利用非氧化還原原理設(shè)計(jì)了2 ，4 一二硝基磺酸酯 類(lèi)熒光素用于檢測(cè)超氧陰離子的熒光探針【38 1 ，用于人類(lèi)嗜中性粒細(xì)胞中超氧陰離 子的檢測(cè)。( 圖3 ) xo ， - - _ - _ - - _ _ - o d n s h n s # 2 枷衲躲炯嘞n 辨w 抽n y i ) 圖32 ，4 一二硝基磺酸酯類(lèi)熒光素探針結(jié)構(gòu)及其與超氧陰離子自由基發(fā)生非氧化還原反應(yīng)生 成熒光素的機(jī)理。d n s 為2 ，4 一二硝基苯磺酸酯 2 0 0 5 年e i t as a s a l 【等根據(jù)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移( p e t ) 理論設(shè)計(jì)了測(cè)定活體器官內(nèi) 一氧化氮的近紅外熒光探針d a c p 和d a c s 。該系列熒光探針的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng) 均處于6 5 0 9 0 0 1 1 i n 的近紅外光區(qū)，生物基體光吸收或熒光強(qiáng)度很小，且致密介質(zhì) ( 如組織) 的光散射大大降低，激發(fā)光的穿透性更大，因而自發(fā)熒光的背景干擾 大大降低，使之更適用于生物活體的檢測(cè)。該探針的檢測(cè)機(jī)理是基于p e t 機(jī)理， 當(dāng)一氧化氮存在時(shí)，電子的激發(fā)使探針?lè)肿觾?nèi)供體和受體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移 ( e t ) ，從而生成不同于初始狀態(tài)的電荷分離態(tài)( c t ) ，隨即可以觀察到熒光 顯著增強(qiáng)的現(xiàn)象。此探針成功運(yùn)用于小鼠腎中一氧化氮的測(cè)定，熒光顯微鏡下觀 察到隨著一氧化氮濃度的增高，探針標(biāo)記的小鼠腎細(xì)胞熒光明顯增強(qiáng)，應(yīng)用熒光 光譜儀掃描得到熒光光譜，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度與一氧化氮的濃度成線性關(guān)系，進(jìn)一步 證實(shí)了此近紅外熒光探針應(yīng)用于檢測(cè)生物器官內(nèi)一氧化氮的可行性及實(shí)用性 【3 9 j 。( 圖4 ) 圖4 用于檢測(cè)一氧化氮的熒光探針結(jié)構(gòu)及其i e t 反應(yīng)機(jī)理圖 9 山東師范大學(xué)碩士論文 同年本課題組設(shè)計(jì)合成了選擇性測(cè)定細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的近紅外熒光探針萘 熒光素二磺酸酯( n f d s 1 ) ，探針自身不發(fā)熒光，當(dāng)與過(guò)氧化氫結(jié)合后恢復(fù)為熒 光物質(zhì)萘熒光素，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。運(yùn)用探針誘導(dǎo)加入過(guò)氧化氫的小鼠腹腔巨噬細(xì) 胞，獲得細(xì)胞的顯微熒光成像，證實(shí)了探針對(duì)過(guò)氧化氫的選擇性識(shí)別作用 4 0 1 。( 圖 5 ) 圖5 近紅外熒光探針萘熒光素二磺酸酯( n m s 1 ) 的結(jié)構(gòu)及其與過(guò)氧化氫反應(yīng)機(jī)理 2 0 0 6 年本課題組設(shè)計(jì)合成了一種新型用于選擇性測(cè)定細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自 由基的熒光探針3 ，6 一二苯基磷熒光素( p f 1 ) ，探針捕獲超氧的反應(yīng)機(jī)理是基于 超氧陰離子自由基對(duì)探針引起的親核反應(yīng)，導(dǎo)致了羥基的去保護(hù)從而產(chǎn)生了強(qiáng)熒 光的產(chǎn)物熒光素。并通過(guò)進(jìn)行細(xì)胞的共聚焦熒光顯微成像，證實(shí)了探針對(duì)超氧陰 離子自由基的選擇性識(shí)別作用【4 1 1 。( 圖6 ) 0 p h 2 p o 一二h 靜& 三妒羅2 ， 一9 0 鉗臥2 _ o 堅(jiān)2 p ( o ) o ho o + 2 p 噸p o ) o h 圖63 ，6 一二苯基磷熒光素( p f 一1 ) 結(jié)構(gòu)及與超氧陰離子反應(yīng)機(jī)理 脂質(zhì)過(guò)氧化是發(fā)生在細(xì)胞膜上的一種重要的氧化過(guò)程，與很多疾病的發(fā)生有 關(guān)，從而逐漸引起人們的關(guān)注。目前己用于檢測(cè)脂質(zhì)自由基的熒光探針主要有兩 種，一種是d i p h e n y l 1 一p ) r r e n y l p h o s p l l i n e ( d p p p ) ，2 0 0 0 年0 1 ( i m o t o 課題組用該熒光 探針檢測(cè)了脂質(zhì)氫過(guò)氧化物，并實(shí)現(xiàn)了在小鼠p 細(xì)胞中的熒光成像【4 2 】。2 0 0 1 年，t a k a h a s h i 等人也用d p p p 實(shí)現(xiàn)了對(duì)脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的檢測(cè)，并成功將該探針 1 0 山東師范大學(xué)碩士論文 孵育進(jìn)入u 9 3 7 細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的熒光顯微成像【4 3 】。另一種是3 p e 聊e 1 1 e d i p h e n y l p h o s p l l i n e ( 3 一p e d p p ) ，與d p p p ( 九能九哪= 3 5 1 3 8 0 衄) 相比，3 - p e d p p 的 激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)( k x = 4 4 0 4 7 咖m ) 【伽。兩種探針都是基于探針中磷原 子的氧化機(jī)理而發(fā)生價(jià)態(tài)改變，磷原子周?chē)娮用芏仍龃?，探針熒光恢?fù)從而實(shí) 現(xiàn)對(duì)脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的檢測(cè)。( 圖7 、圖8 ) 圖7d p p p 的結(jié)構(gòu)及與脂質(zhì)氫過(guò)氧化物反應(yīng)機(jī)理 喝斗晦 圖83 一p e d p p 的結(jié)構(gòu)及與脂質(zhì)氫過(guò)氧化物反應(yīng)機(jī)理 、。 第二節(jié)生物活性分子的生理作用m 1 及其檢測(cè)技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)介 1 - 生物活性分子的種類(lèi) 生物分子是生物體最重要的組成部分，約占生物體質(zhì)量的三分之一以上。生 物分子是生物體和生命現(xiàn)象的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和功能基礎(chǔ)，是生物化學(xué)研究的基本對(duì) 象。生物分子的主要類(lèi)型包括糖、脂、核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子以及維生素、 輔酶、激素、核苷酸和氨基酸等。其中最重要的是糖、脂、核酸和蛋白質(zhì)，他們 是構(gòu)成生命體和維持生命現(xiàn)象最基本的物質(zhì)。 1 1 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及生理作用 蛋白質(zhì)是一類(lèi)含氮有機(jī)化合物，并且占生物組織中所有含氮物質(zhì)的絕大部 山東師范大學(xué)碩士論文 分。蛋白質(zhì)可以被酸、堿或蛋白酶催化水解，最后得到各種氨基酸的混合物。所 以，氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元。雖然蛋白質(zhì)種類(lèi)繁多，但是大多數(shù)的蛋白 質(zhì)都是由2 0 種基本氨基酸組成。多肽是由氨基酸以酰胺鍵形式連接而成的線形大 分子。蛋白質(zhì)是由一個(gè)或多個(gè)多肽鏈通過(guò)共價(jià)鍵( 主要是二硫鍵) 或非共價(jià)力結(jié) 合而成。 蛋白質(zhì)是最重要的一類(lèi)生物大分子。它存在于所有的生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生 物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，它參與了幾 乎所有的生命活動(dòng)過(guò)程。例如生物體內(nèi)發(fā)生的催化作用、代謝過(guò)程、免疫作用、 物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信息傳遞、運(yùn)動(dòng)和生物調(diào)控等，都有蛋白質(zhì)的直接參與并起著重要作 用。與蛋白質(zhì)復(fù)雜的生物功能相對(duì)應(yīng)，蛋白質(zhì)具有非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。對(duì)蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究，不僅對(duì)于從分子水平上解釋生命現(xiàn)象的化學(xué)本質(zhì)具有重 要意義，而且對(duì)工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和環(huán)保等領(lǐng)域的發(fā)展也有深遠(yuǎn)影響。 1 2 酶的分類(lèi)、性質(zhì)及生理作用 酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的類(lèi)具有催化功能的生物分子，又稱(chēng)生物催化劑。絕大多 數(shù)的酶都是蛋白質(zhì)。根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類(lèi)型，酶有水解酶( 包括淀粉酶、蛋白 酶、核酸酶及脂酶等) 、氧化還原酶( 包括脫氫酶和氧化酶) 、轉(zhuǎn)移酶、裂合酶( 包 括醛縮酶、水化酶及脫氨酶) 、異構(gòu)酶、合成酶和核酸酶。其中核酸酶是唯一的 非蛋白酶。根據(jù)酶的組成可以將酶分為單純蛋白酶和結(jié)合蛋白酶。結(jié)合蛋白酶的 蛋白部分成為酶蛋白，非蛋白質(zhì)部分包括輔酶及金屬離子。已知的酶基本上都是 復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子，不同的酶除了具有不同的一級(jí)結(jié)構(gòu)以外，還具有特殊的空間 結(jié)構(gòu)。酶分子中的肽鏈通過(guò)折疊、螺旋或纏繞形成了酶的活性空間，即酶的活性 部位。酶的復(fù)雜的催化作用及時(shí)取決于它的特殊結(jié)構(gòu)。 在酶的作用下，許多生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程可以在溫和的條件下( 如室溫、常壓 和水溶液中) 以很高的速率和效率進(jìn)行。所以，酶是維持生命體內(nèi)正常的生理活 動(dòng)和新陳代謝的基本條件?？梢哉f(shuō)，沒(méi)有酶就沒(méi)有生物體的生理活動(dòng)和新陳代謝， 也就沒(méi)有生命。 2 生物體還原性物質(zhì)分類(lèi)及其生理功能 人體本身存在有兩大抗氧化系統(tǒng)，一為酵素型( 酶) ，如：超氧化物歧化酶 ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e 簡(jiǎn)稱(chēng)s o d ) ，它是消除超氧陰離子自由基的酶；谷胱甘肽過(guò) 1 2 山東師范大學(xué)碩士論文 氧化酶( g l u t a t m o n ep e r o x i d a s e ，g p x ) 和還原酶( 9 1 u t 甜l i o n er e d u c t a s e ，g r ) ：過(guò)氧化 氫酶( c a t a l a l s e ，c a t ) ，它是消除過(guò)氧化氫和羥自由基的酶等。人體本身可進(jìn)行體 內(nèi)合成。另一種為非酵素型，谷胱甘肽( g l u t a t l l i o n e ) 、半胱氨酸( c y s t e i l l e ) 、硫 辛酸( 1 i p o i ca c i d ) 、尿酸( 證ca c i d ) 等。有些抗氧化劑人體不能合成，只能通過(guò) 膳食攝取獲得，如維生素c ( v i t 鋤i nc ) 和維生素e ( 生育酚t o c o p h e r 0 1 ) 、b 一胡 蘿卜素( b c 啪t e n e ) 、硒微量元素、黃酮類(lèi)物質(zhì)等。這些被稱(chēng)之為外源型抗氧 化劑。維生素c 能增強(qiáng)體內(nèi)免疫力，抗氧化能力，消除自由基。維生素e 是人體最重 要的脂溶性抗氧化維生素，可以避免細(xì)胞膜的脂肪被自由基氧化，對(duì)于極易被氧 化的紅細(xì)胞，蛋白分子可提供強(qiáng)大的保護(hù)作用，可以避免低密度脂蛋白( l d l ) 的 氧化。b 一胡蘿卜素是類(lèi)胡蘿卜素的一種，是非常有效的抗氧化劑，擅于捕捉氧自 由基，它會(huì)在肝臟中轉(zhuǎn)換成維生素a ，對(duì)于避免肺癌有明顯的效果，對(duì)細(xì)胞膜也有 保護(hù)的作用?？寡趸牡V物質(zhì)如銅是許多蛋白質(zhì)和酵素的重要成分，特別對(duì) s o d ( 超氧化物歧化酶) 的形成，具有促進(jìn)的作用，是抗氧化成分之一；硒是體內(nèi)抗 氧中谷胱甘肽過(guò)氧化g p x 的促進(jìn)因子，g p x 可以解除過(guò)氧化氫的潛在傷害，保護(hù)細(xì) 胞和血液免受自由基的侵害。另外，硒可以抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)機(jī)體免疫 力的提升有很大的幫助。鋅是維持生命的必須物質(zhì)，是s o d 的促進(jìn)因子，并且能 強(qiáng)化s o d 的活性，是抗氧化的成分之一，對(duì)d n a 的合成和細(xì)胞的分裂非常重要。 鐵是組成血紅素和肌紅素的主要物質(zhì)，最主要的功能是運(yùn)輸氧氣。它是能量代謝 過(guò)程中的重要物質(zhì)，參與許多酵素系統(tǒng)的運(yùn)作，對(duì)免疫系統(tǒng)有增進(jìn)作用避免貧血， 增加抗氧化能力。 酶類(lèi)抗氧化劑是預(yù)防性抗氧化劑，可以在脂質(zhì)過(guò)氧化前就將啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化 的自由基，如0 2 。和h o 清除掉，預(yù)防脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生。維生素c 和e 等是鏈阻 斷抗氧化劑，可在脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中將脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)阻斷。茶多酚和黃酮 類(lèi)具有兩種功能。 目前生物體內(nèi)還原性物質(zhì)研究較多的是含巰基的物質(zhì)，即硫醇類(lèi)物質(zhì)。硫醇 是生物體中許多蛋白質(zhì)和小分子的重要組成部分，在細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)中具有重要 的作用【4 6 1 。它在生物體中以非蛋白和與蛋白結(jié)合形式存在。非蛋白硫醇主要包括 谷胱甘肽，半胱氨酸等小分子，蛋白硫醇( 又稱(chēng)巰基蛋白) 主要有硫氧還蛋白、 金屬硫蛋白及一些含硒的酶類(lèi)物質(zhì)如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，谷胱甘肽還原酶等。 其中谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)含量最高的非蛋白硫醇( 約1 1 0m m ) ，它具有維持細(xì)胞 山東師范大學(xué)碩士論文 內(nèi)還原環(huán)境的作用。而且由于硫醇存在著氧化態(tài)和還原態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡，所以谷胱 甘肽又起到細(xì)胞還原調(diào)節(jié)劑的作用【4 8 】。 3 生物活性分子檢測(cè)技術(shù)發(fā)展概況 細(xì)胞內(nèi)硫醇的濃度隨著氧化性物質(zhì)的侵入會(huì)發(fā)生顯著變化，因此，定量檢測(cè) 細(xì)胞內(nèi)硫醇的濃度對(duì)于研究細(xì)胞功能具有重要意義。目前已報(bào)道的用于檢測(cè)硫醇 的方法主要有：高效液相色譜法、a g s 膜電極法、熒光法等。高效液相色譜法 ( 卸p l c ) 是一種廣泛應(yīng)用的用于在化學(xué)體系中檢測(cè)硫醇的方法【4 9 ，5 0 1 ，應(yīng)用經(jīng)典的 巰基顯色劑e l h t l a n 試劑( d t n b ) 對(duì)樣品中的巰基進(jìn)行衍生化后進(jìn)行檢測(cè)。這種方 法靈敏度高而且結(jié)果可靠，但是操作不方便、費(fèi)時(shí)費(fèi)力并且只能用于進(jìn)行活體外 檢測(cè)。r e c l l i l i t z 等人使用a g s 膜電極進(jìn)行了體外模擬體系中谷胱甘肽和谷胱甘肽 還原酶活性的檢測(cè)【5 l 】。一些二胺衍生物常作為檢測(cè)硫醇的熒光標(biāo)記探針【5 2 5 4 1 ，其 中雙溴二胺( b b b r ) 【5 2 1 和單氯二胺( m c b ) 【5 3 1 是兩種常用方法。但是雙溴二胺對(duì) 硫醇選擇性不高，而且兩種方法均不能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)測(cè)定。 熒光法與這幾種方法相比較在靈敏度、選擇性及可應(yīng)用于活體甚至單個(gè)細(xì) 胞的成像方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。m a e d a 等人用2 ，和二硝基苯磺酰熒光素作為熒光探針 進(jìn)行硫醇酶的定量檢測(cè)，基于巰基的親核作用，使熒光較弱的探針恢復(fù)其母體熒 光素的結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)硫醇酶的檢測(cè)。但是所設(shè)計(jì)探針容易水解，因此也不適 合進(jìn)