1、氨基酸的分離鑒定--紙層析法.doc

實驗一：氨基酸的分離鑒定-紙層析法一、 目的：通過氨基酸的分離，學習紙層析法的基本原理及操作方法。二、 原理：層析法也叫色譜法，是一種物理分離方法，它是利用混合物中各組分的物理、化學性質(zhì)的差異，使各組分以不同的程度分布在兩個相中，其中一個相為固定相，另一個相則流過此固定相（稱流動相）并使各組分以不同的速度移動從而達到分離。層析法是近代生物化學最常用的分析方法之一，運用這種方法可以分離性質(zhì)極為相似而用一般化學方法難以分離的各種化合物。如各種氨基酸、核苷酸、糖、蛋白質(zhì)等。層析法有許多種類，根據(jù)分離所依據(jù)的理化性質(zhì)不同，可分為吸附層析、分配層析、離子交換層析等。紙層析是生物化學上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定；也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有機酸、維生素、抗生素等物質(zhì)的一中分離分析工具。紙層析屬于分配層析法。分配層析法是一種連續(xù)抽提法，利用不同的物質(zhì)在兩個互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)的不同而得到分離。紙層析以濾紙作為惰性支持物，濾紙纖維素上的羥基具有親水性，能吸附一層水，把吸附在濾紙上的水作為固定相，展層用的有機溶劑為流動相。水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相：由于纖維素上的羥基具有親水性，和水以氫鍵相連，使這部分水不易擴散，所以能與跟水混合的溶劑仍然形成類似不相混合的兩相。當有機相沿紙流動經(jīng)過層析點時，層析點上的溶質(zhì)就在水相和有機相之間進行分配，有一部分溶質(zhì)離開原點隨有機相而進入無溶質(zhì)的區(qū)域，這時，又重新分配，一部分溶質(zhì)從有機相進入水相。當有機相不斷流動時，溶質(zhì)就沿著有機相流動的方向移動，不斷分配。溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動速率也不同，因而可以彼此分開。紙上層析法的一般操作是將混合物點到紙上，干后讓溶劑從有樣品的一端經(jīng)毛細作用流到紙的另一端。在密閉的容器中層析溶劑沿濾紙的一個方向反復抽提，由于混合氨基酸在兩相中的分配系數(shù)（當把一種物質(zhì)在兩種不相溶的溶劑中振蕩時，它將在這兩相中不均勻分配。達到平衡時，這種物質(zhì)在兩種溶劑中的濃度之比為一個常數(shù)，即所謂的分配常數(shù)，用表示）不同，使不同的氨基酸分布在濾紙的不同位置上而得到分離。一種物質(zhì)在兩種溶劑中的濃度之比是一個常數(shù)，也就是分配系數(shù)（a）。分配系數(shù)不同： 物質(zhì)在溶劑I中的濃度a = 物質(zhì)在溶劑II中的濃度某一種物質(zhì)在特定的溶劑系統(tǒng)、紙、展層方式、溫度、pH等條件下的Rf值基本上是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、紙層析紙的質(zhì)量（新華一號）和層析溫度等因素有關(guān)。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置Rf值（比移）來表示： 原點到層析點中心的距離 Rf = 原點到溶劑前沿的距離印三酮顏色反應(yīng)：印三酮在弱酸溶液中與a-氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氧、脫羧反應(yīng)，最后印三酮與反應(yīng)產(chǎn)物-氨和還原印三酮（hydrindantin）發(fā)生作用，生成紫色物質(zhì)（NH3與印三酮反應(yīng)形成紫色化合物）。用紙層析法或柱層析把各種氨基酸分開后，利用印三酮顯色可以定性鑒定應(yīng)用分光光度法在570nm定量測定各種氨基酸。賴氨酸脯氨酸（黃色）纈氨酸苯丙氨酸亮氨酸兩個亞氨基酸，脯氨基酸和羥脯氨基酸與印三酮反應(yīng)不釋放NH3，而直接產(chǎn)生亮黃色化合物，最大光吸收在440nm。三、 器材；1、層析缸（兩人一組，四組共用一個層析缸）；2、培養(yǎng)皿（兩人一組）；3、毛細管（藥品是兩組共用一套）；4、噴霧器；5、層析濾紙（新華一號）四、 試劑1、 擴展劑：4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物（p.123）；（水飽和的正丁醇和乙酸的混合物。其中被濾紙吸附的水為固定相，正丁醇為流動相 ，乙酸為層析提供酸性環(huán)境。）2、 氨基酸溶液: 0.5%的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液（各組分均為0.5%）；3、 顯色劑：0.1%水合印三酮正丁醇溶液五、 操作：1、 平衡：將盛有平衡溶劑的培養(yǎng)皿放入密閉的層析缸中，倒1厘米厚的擴展劑；2、 濾紙（新華一號或者Whatman-1號）：在紙的一端距邊緣23cm處用鉛筆劃一條直線，在直線上每隔2cm作一記號（如書p.123），共6個記號，這個記號是樣品Rf值計算的原點；3、 點樣：用毛細管將各氨基酸樣品分別點在這6個位置上，點樣量以3040L為宜，每點一次樣，用吹風機吹干，然后再點一次；重復點樣34次。注意：點樣時毛細管垂直輕輕接觸濾紙，一觸即止，每個點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm。4、 擴展：用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸（避免由于毛細管現(xiàn)象使溶劑沿兩邊移動過快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值）。濾紙直立于培養(yǎng)皿中，點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1cm。待溶劑上升15cm時取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或吹風機吹干。5、 顯色：用噴霧器均勻噴上0.1%印三酮正丁醇溶液（與水不混溶且揮發(fā)性較大的溶劑），用熱風吹干（或烘箱100烘烤5分鐘）顯出個層析斑點（為什么這兒要熱風？氨基酸與印三酮共熱反應(yīng)顯色）。六、 結(jié)果與分析：計算各種氨基酸的Rf值?！咀⒁馐马棥?、取濾紙之前要將手洗干凈，防止手上的汗?jié)n污染濾紙，并盡可能少接觸濾紙；在條件允許的情況下也可戴一次性手套拿濾紙。要將濾紙平放在干凈的報紙上，千萬不要放在實驗臺上，以防止污染。2、點樣點（垂直點樣）的直徑不能超過3mm，否則分離效果不好，并且樣品用量過大，會造成“拖尾”現(xiàn)象；點樣一次后立即吹干，然后再點。平衡劑的作用：平衡劑起到使紙層析上吸附的溶劑達到飽和，使物質(zhì)在展開劑和紙層析上吸附的溶劑中溶解度不同而分離。展層方式有上行、下行和環(huán)行。雖然其方式可以不同，但其共同點都是將點好樣品的濾紙固定，讓溶劑擴展，層析缸內(nèi)保持恒定的蒸氣壓并保持恒溫，減少溫度波動使溶劑走的不均勻，從而改變Rf值。上行層析是比較常用的方法，它的優(yōu)點是可以在兩個方向上進行（雙向?qū)游觯?。下行層析適用于一些Rf值接近的混合物。此時不能測定Rf值，而只能與標準參考物相比較。附：影響Rf值的因素1、物質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑（水）中，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑（有機溶劑）中，所以物質(zhì)的極性大小決定了物質(zhì)在水和有機溶劑之間的分配情況。例如酸性和堿性氨基酸的極性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配較多，因此Rf值低于后者。氨基酸的極性愈大，Rf值愈小。CH2基（亞甲基）是疏水性基團，如果分子中極性基數(shù)不變，則CH2基增加，整個分子的極性降低，因此易溶于有機溶劑（流動相）中，Rf值也隨之增加。例如氨基酸的Rf值 ：甘氨酸 丙氨酸 亮氨酸 ；二羧基氨基酸中，天門冬氨酸 谷氨酸。極性基團的位置不同也會引起Rf值變化。紙層析時，由于各個氨基酸在兩個溶劑系統(tǒng)中具有不同的Rf值，因此被分開（可以用雙向紙層析法）。當混合物中所含的氨基酸種類較少，Rf值彼此差距比較大，則在同一溶劑系統(tǒng)進行單向?qū)游黾纯伞?、溶劑的影響：同一種物質(zhì)在不同溶劑中Rf值不同，選擇溶劑系統(tǒng)時應(yīng)該使被分離物質(zhì)在適當Rf值范圍內(nèi)（0.05-0.85之間），并且不同物質(zhì)的Rf值至少差別為0.05才能彼此分開。溶劑的極性大小也影響物質(zhì)的Rf值，在用與水互溶的脂肪醇作為溶劑時，氨基酸的Rf值隨著溶劑碳原子數(shù)目的增加而降低。3、pH的影響：溶劑系統(tǒng)的pH會影響物質(zhì)極性基團的解離形式。對于酸性氨基酸則在酸性時所帶凈電荷比堿性時少。帶電荷愈少親水性愈小，因此在酸性溶劑中Rf值較堿性大。而堿性氨基酸則與此相反。借此性質(zhì)用酸相和堿相溶劑進行雙向?qū)游觯墒顾釅A性不同的氨基酸達到分離的目的。溶劑的pH還可以影響有機溶劑的含水量，溶劑酸堿度大，則含水量高。對于極性物質(zhì)來說Rf值增加，非極性物質(zhì)則減少。若pH值不適合，使同種物質(zhì)有不同解離形式，其Rf值也略有不同，則此物質(zhì)層析呈帶狀圖譜。因此溶劑中的酸或堿的含量必須足夠，并且層析缸中用酸或堿氣體飽和才可以防止上述現(xiàn)象，使物質(zhì)得到圓點狀圖譜。4、濾紙的影響：層析濾紙必須質(zhì)地均勻、緊密、有一定機械強度，并且雜質(zhì)較少，如紙中有Ca2+、Mg2+、Cu2+等金屬離子雜質(zhì)，可與氨基酸形成絡(luò)合物使層析圖譜出現(xiàn)陰影，可用稀酸洗滌濾紙除去之。一般分析工作可采用新華1號濾紙（或者Whatman 1號），若有較多樣品需要在紙上分離提純時則適合采用新華3號（或Whatman 3號）厚紙，但厚紙的分辨率比1號濾紙差。溶劑順著紙的紋道擴展速度快，否則速度慢。5、溫度和時