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ctDNA檢測(cè)技術(shù)循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死或分泌產(chǎn)生的DNA片段，是循環(huán)游離DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)的一部分1。ctDNA含有與其來(lái)源腫瘤DNA同樣的基因缺陷，如點(diǎn)突變，重排，擴(kuò)增等2；其在血液中的半衰期短，可實(shí)時(shí)反映腫瘤的動(dòng)態(tài)變化3;作為液體活檢的一種，可克服組織活檢中由于腫瘤異質(zhì)性帶來(lái)的缺陷，檢測(cè)更全面4,因此ctDNA的檢測(cè)可用于癌癥早期診斷與癌癥分期、腫瘤的療效評(píng)估、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷等5。由ctDNA的質(zhì)量和數(shù)量變化大, 因此需要高特異性和高靈敏度的檢測(cè)方法。目前常用的方法有數(shù)字PCR (digital PCR, dPCR)、BEAMing (bead, emulsion,amplification and magnetic)、高通量測(cè)序(next generation sequencing, NGS)、ARMS等6。1.數(shù)字PCR1999年Vogelstein等提出了數(shù)字PCR(digtal PCR,dPCR)的概念7。數(shù)字PCR包括兩部分，即PCR 擴(kuò)增和熒光信號(hào)分析。先將是樣品稀釋后分配到大量微小的反應(yīng)單元中，每個(gè)單元包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子,然后分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行采集。數(shù)字PCR采用直接計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行定量分析, 有熒光信號(hào)的反應(yīng)單元中至少包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，記為1，無(wú)熒光信號(hào)的則即為0，理論上，在樣品中極限稀釋的情況下，有熒光信號(hào)的反應(yīng)單元數(shù)目等于目標(biāo)DNA 分子的拷貝數(shù)。但是有的反應(yīng)單元中可能包含兩個(gè)或兩個(gè)以上的目標(biāo)分子，這時(shí)需要用泊松概率分布公式進(jìn)行計(jì)算8。不同于傳統(tǒng)的qPCR技術(shù),數(shù)字PCR 不受擴(kuò)增曲線(xiàn)的循環(huán)閾值(CT) 和擴(kuò)增效率的影響，無(wú)需參照，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析9。根據(jù)反應(yīng)單元類(lèi)型不同，數(shù)字PCR分為三類(lèi): 微反應(yīng)室/ 孔板數(shù)字PCR、微流控芯片和微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。微反應(yīng)室/孔板數(shù)字PCR借助高通量自動(dòng)上樣設(shè)備和增加的反應(yīng)單元數(shù),實(shí)現(xiàn)快速精確取樣，提高檢測(cè)靈敏度。微流控芯片技術(shù)是一種基于含有數(shù)千個(gè)超高密度親疏水微孔芯片的dPCR平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)高通量、低成本分析。微滴數(shù)字PC( droplet digital PC,ddPCR)是將含有目標(biāo)分子的樣品分成成千上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的油包水微滴，再對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行擴(kuò)增，和熒光信號(hào)的采集，更容易實(shí)現(xiàn)小體積和高通量10。數(shù)字PCR可絕對(duì)定量，是目前靈敏度最高的檢測(cè)技術(shù)，但其也存在一定缺點(diǎn)，如生成的微滴必須服從泊松分布，所以不適合高濃度DNA樣本檢測(cè)，；只能檢測(cè)已知的突變且一次只能檢測(cè)一種突變11,12。2.BEAMing技術(shù)BEAMing技術(shù)在檢測(cè)ctDNA內(nèi)體腫瘤突變具有非常高的靈敏度，它是結(jié)合了數(shù)字PCR以及流式技術(shù)的一種檢測(cè)方法，最早是由Bert Vogelstein提出。其方法是每一類(lèi)DNA分子都會(huì)專(zhuān)一的與磁性珠相連接，然后DNA分子之間的差異可以通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記來(lái)做出評(píng)估。這種方法是基于小珠(Bead)、乳濁液(Emulsion)、擴(kuò)增(Amplification)、磁性(Magnetic)，這四個(gè)主要組分來(lái)構(gòu)建的，所以被稱(chēng)作為BEAMing13。 BEAMing 技術(shù)的過(guò)程包括：首先是分離和純化血漿中的DNA；接著是預(yù)擴(kuò)增步驟，通過(guò)使用常規(guī)PCR 擴(kuò)增目的基因片段，使用引物與已知的標(biāo)記序列混合；然后，這些DNA 模板再通過(guò)乳液PCR 擴(kuò)增，應(yīng)用引物探測(cè)這些序列，通過(guò)鏈酶親和素磁珠相互作用與有磁性的微膠珠結(jié)合。通過(guò)這種方式設(shè)計(jì)的系統(tǒng)，在反應(yīng)結(jié)束之前，每個(gè)乳液液滴中生成的PCR 產(chǎn)物將保持對(duì)微膠珠的附著性，使其可以很容易地通過(guò)磁性進(jìn)行分離和純化14。并且，BEAMing技術(shù)是利用磁珠來(lái)吸附游離DNA，它可以從1萬(wàn)個(gè)健康細(xì)胞DNA中檢測(cè)出那一個(gè)ctDNA分子，具有較高的敏感性，同時(shí)在很多研究中其在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的突變都和ctDNA部分突變是一致的15,16。BEAMing技術(shù)相比其他檢測(cè)技術(shù)具有很多優(yōu)勢(shì)：（一）在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下，數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA分子可以通過(guò)該種方法來(lái)進(jìn)行評(píng)估。（二）特異的突變可以通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離篩選以備進(jìn)一步分析和研究。（三）BEAMing技術(shù)可以用來(lái)對(duì)特定組織或者人群中罕見(jiàn)的突變，以及研究一般基因序列或轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物的變異都可以提供相應(yīng)的鑒別和定量分析。由于外周血流中ctDNA 拷貝的數(shù)量是很低的，特別是相較于野生型DNA 來(lái)說(shuō)。出于這個(gè)原因，使用PCR 進(jìn)行DNA 擴(kuò)增是BEAMing 過(guò)程中的一個(gè)重要部分，是確?？煽繖z測(cè)的保證5。然而，BEAMing 這項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)只能檢測(cè)已知突變，且成本較高17 同時(shí)，它的操作也較復(fù)雜，通量低，且單分子擴(kuò)增在非均一的微滴中實(shí)現(xiàn)，需要RCR預(yù)擴(kuò)增，會(huì)增加試驗(yàn)誤差12。3.基于NGS技術(shù)的檢測(cè)方法ctDNA檢測(cè)技術(shù)，除了基于PCR檢測(cè)方法之外，還有一種以高通量測(cè)序技術(shù)，又稱(chēng)“下一代”測(cè)序技術(shù)（NGS）為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法主要是選定十幾到幾十個(gè)腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序通量和效率高。根據(jù)富集策略的不同，基于NGS的技術(shù)目前又可分為靶向擴(kuò)增子測(cè)序(TAS)及目標(biāo)序列捕獲測(cè)序(TCS)。靶向擴(kuò)增子測(cè)序(TAS)技術(shù)是針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)幾十對(duì)甚至上百對(duì)PCR引物，利用多重PCR擴(kuò)增富集。代表性方法有標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序(TAM-Seq)。Forshew等18 通過(guò)TAM-Seq測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)患者癌細(xì)胞中ctDNA片段，從而找到腫瘤樣品中的遺傳突變。這種方法無(wú)需外科手術(shù)或者活檢，就可以找到癌癥突變。目標(biāo)序列捕獲測(cè)序(TCS)技術(shù)是針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)探針，通過(guò)捕獲雜交的方法富集，代表性方法有深度測(cè)序腫瘤個(gè)體化建檔法（CAPP-Seq）。Newman等19從腫瘤基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)找復(fù)發(fā)突變相關(guān)的外顯子，再?gòu)哪[瘤基因圖譜庫(kù)的407位非小細(xì)胞肺癌患者全基因組測(cè)序結(jié)果篩選。然后應(yīng)用迭代算法使每個(gè)非小細(xì)胞肺癌患者樣本的錯(cuò)義突變最大化來(lái)簡(jiǎn)化篩選器(selector)的大小，最后的selector能識(shí)別139個(gè)復(fù)發(fā)突變基因中的521個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度約為125kb，平均能夠識(shí)別4個(gè)單核苷酸突變（SNV），在96%的肺腺癌或鱗癌患者身上有效?；贜GS技術(shù)的檢測(cè)方法靈敏度高，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的多種變異。但是其技術(shù)復(fù)雜，數(shù)據(jù)處理困難，實(shí)驗(yàn)室水平差異較大，儀器與試劑的成本相對(duì)較高。想要臨床應(yīng)用，首先要將其標(biāo)準(zhǔn)化12。4.ARMS技術(shù)ARMS，全稱(chēng)為突變擴(kuò)增系統(tǒng)（Amplification refractory mutation system），是由Newton等人首先建立并用于檢測(cè)基因已知突變的方法20。利用PCR引物3端堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能進(jìn)行有效擴(kuò)增的基本原理，根據(jù)已知突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，使3末端堿基分別與突變和野生型模板堿基進(jìn)行互補(bǔ)，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，達(dá)到將“突變”模板與“野生”模板區(qū)分的目的12。ARMS法的主要特點(diǎn)有高特異性，高靈敏度以及耗時(shí)短，成本低，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。其檢測(cè)結(jié)果的高特異性關(guān)鍵在于引物設(shè)計(jì)。ARMS法所用的引物是通過(guò)篩選能夠識(shí)別單個(gè)位點(diǎn)等位基因的引物，進(jìn)而保證了結(jié)果的高特異性。而ARMS法檢測(cè)點(diǎn)突變的檢出率還取決于PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化和防止引物與靶DNA錯(cuò)配可能發(fā)生的錯(cuò)配延伸。PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化可以通過(guò)改變引物濃度、靶DNA濃度、Taq酶濃度以及反應(yīng)體系溫度進(jìn)行調(diào)整21。此外，在反應(yīng)體系中加入甲酰胺可以減少非特異性擴(kuò)增，在引物3末端引入第二個(gè)錯(cuò)配堿基也可以提高引物的特異性21。通過(guò)在體系中加入多對(duì)引物可以實(shí)現(xiàn)多重?cái)U(kuò)增，實(shí)現(xiàn)基因的多位點(diǎn)突變檢測(cè)22。ARMS法檢測(cè)靈敏度明顯高于直接測(cè)序法等其他方法，可檢測(cè)出樣品中含量低至0.1%1.0%的突變基因；且該方法結(jié)合PCR技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，成本低，結(jié)果直觀23。目前，ARMS法已成為國(guó)際上腫瘤個(gè)體化分子檢測(cè)最重要、最先進(jìn)的技術(shù)之一，其在臨床應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)已被業(yè)內(nèi)專(zhuān)家廣泛認(rèn)可。但該方法只能用于檢測(cè)已知突變，在一定程度上限制其應(yīng)用。ARMS法檢測(cè)可以分為實(shí)時(shí)熒光定量PCR和巢式ARMS法電泳檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指ARMS技術(shù)結(jié)合探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，在實(shí)時(shí)定量PCR平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品DNA中稀有突變的檢測(cè)24。而巢式ARMS法電泳檢測(cè)是利用凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增帶，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)果分析25。隨著ARMS技術(shù)的發(fā)展，商品化的ARMS試劑盒相繼問(wèn)世，包括人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因突變檢測(cè)試劑盒，人KARS基因突變檢測(cè)試劑盒，四項(xiàng)耳聾基因檢測(cè)試劑盒等13。總結(jié) 作為重要的腫瘤分子標(biāo)志物，ctDNA在腫瘤的診斷、治療監(jiān)測(cè)、預(yù)后等方面發(fā)揮著重要的作用，而DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得通過(guò)檢測(cè)ctDNA來(lái)指導(dǎo)腫瘤的臨床進(jìn)展變得更加切實(shí)可行。數(shù)字PCR技術(shù)、BEAMing技術(shù)、NGS技術(shù)、ARMS技術(shù)在ctDNA的檢測(cè)中各具其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和不足之處，實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)結(jié)合具體條件決定采用何種檢測(cè)方法。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，ctDNA 將會(huì)逐漸從科研領(lǐng)域向臨床轉(zhuǎn)化發(fā)展。參考文獻(xiàn)1 Yong E. 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