結球甘藍春化相關基因BoVIN的克隆及其表達分析

園 藝 學 報 2012， 39 （6） ： 10991106 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：收稿日期：20120312；修回日期：修回日期：20120506 基金項目：基金項目：黑龍江省自然科學基金項目（C201039） ；東北農業(yè)大學創(chuàng)新團隊項目（CXT002-2-2） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yxh100 ；jxm0917 ） 結球甘藍春化相關基因 BoVIN3 的克隆及其表 達分析 趙榮秋，胡 遠，蔣欣梅*，于錫宏* （東北農業(yè)大學園藝學院蔬菜生理與設施園藝研究室，哈爾濱 150030） 摘摘 要：要：根據(jù)已報道的擬南芥春化相關基因 VIN3 設計引物，通過 RT-PCR 方法首次從結球甘藍中克 隆得到兩條春化相關基因BoVIN3的cDNA ORF編碼區(qū)序列， 各1 680 bp， GenBank登錄號分別為JQ394927 和 JQ394928，可編碼由 560 個氨基酸組成的蛋白質；與擬南芥 VIN3 基因在核酸水平上同源性分別達到 85.55%和 79.95%；與擬南芥氨基酸序列同源性分別為 80.72%和 72.96%。半定量 RT-PCR 表達分析表明 BoVIN3 受春化作用的誘導，只在感應低溫的莖尖生長點表達，在其它部位不表達，并且其轉錄產物隨春 化時間延長逐漸積累，在春化 42 d 時達到峰值；而在不同濃度 GA3和 KT 誘導下不表達；FLC 受春化作 用的抑制，并且 BoVIN3 受誘導表達后才能使 FLC 的表達受到抑制，暗示在結球甘藍中 BoVIN3 可能參與 春化調控開花的生物學過程，屬于春化特異基因，只響應低溫誘導而轉錄。 關鍵詞：關鍵詞：結球甘藍；VIN3；春化作用；基因表達 中圖分類號：中圖分類號：S 635.1 文獻標識碼：文獻標識碼：A 文章編號：文章編號：0513-353X（2012）06-1099-08 Cloning and Expression Analysis of BoVIN3 from Cabbage ZHAO Rong-qiu，HU Yuan，JIANG Xin-mei*，and YU Xi-hong* （Vegetable Physiology and Installation Horticulture Laboratory，College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China） Abstract：The mid harvest season cabbage varietyGuangrong 1was used in this experiment. Fourteen leaves cabbage plants were vernalized in the incubator at 8 . Two vernalization-related genes were isolated by RT-PCR. Sequencing analysis results showed that their ORF were both 1 680 bp in length，which encoded 560 amino acids，and GenBank accession number are JQ394927 and JQ394928 respectively. Their nucleotide sequences shared 85.55% and 79.95% identity with AtVIN3 respectively， and the deduced amino acid sequence showed homology to AtVIN3 with 80.72% and 72.96%. The expression patterns of the BoVIN3 genes were investigated by semi-quantity RT-PCR，results showed that BoVIN3 gene could express induced by low temperature treatment，and expressed in the stem apex specifically， transcript levels increased with increasing treatment time. The transcription reach the peak at 42 d of vernalization. At the same time the expression of FLC was suppressed after BoVIN3 was induced by low temperature treatment，results suggest that both genes maybe involved in the biological process of flowering 1100 園 藝 學 報 39 卷 regulation in vernalization. However both BoVIN3 could not be induced by GA3 and KT treatment. It indicated that cabbage BoVIN3 was specific vernalization genes，whose transcripts could specially response to vernalization. Key words：cabbage；VIN3；vernalization；gene expression 開花是高等植物實現(xiàn)由營養(yǎng)生長向生殖生長轉變的重要過程，在擬南芥開花調控網絡中， MADS-box 類的轉錄因子 FLOWERING LOCUS C（FLC）處于樞紐地位，是開花調控環(huán)節(jié)中的關鍵 基因（Michaels & Amasino，1999） 。FLC 分別通過結合到 SOC1 啟動子的 CArG 盒上和 FT 第一個 內含子部分區(qū)域（包含 CArG 盒結構）上來抑制它們的表達（Hepworth et al.，2002；Helliwell et al.， 2006） ，從而抑制花分生組織決定基因，進而延遲植物成花。長時間低溫處理促進植物開花的過程稱 為春化作用，春化作用主要是引起開花抑制基因 FLC 染色質結構的改變，以解除其對植物開花的抑 制效應 （Bastow et al.， 2004） 。 研究表明， 春化作用可以誘導 VERNALIZATION INSENSITIVE 3 （VIN3） 的表達，VIN3 與 VERNALIZATION 1（VRN1）和 VERNALIZATION 2（VRN2）一起形成復合體作用 于 FLC 染色質上的組蛋白，使其去乙?；图谆?，從而抑制 FLC 的表達（Bastow et al.，2004； Sung & Amasino，2004；Kim et al.，2006） 。 VIN3 編碼一個 PHD-finger 蛋白，可以參與核小體組蛋白的甲基化去乙?；刃揎棧鹑旧?質結構的重塑。VIN3 被誘導后，F(xiàn)LC 染色質組蛋白上的 H3K9 和 H3K27 發(fā)生二甲基化和三甲基化， 植株表現(xiàn)為早花（Bastow et al.，2004；Sung & Amasino，2004；Kim et al.，2006；Wang et al.，2007； Schmitz & Amasino，2008） 。在 vin3 突變體與野生型植株的研究中，野生型植株在 VIN3 表達后， FLC 染色質組蛋白 H3K9、H3K14 發(fā)生了去乙酰化，而突變體中沒有這一現(xiàn)象，所以認為 VIN3 也 是 FLC 染色質組蛋白 H3K9、H3K14 的去乙?；匦璧模ㄚw仲華 等，2006） 。 Fu 等（2007）從小麥中克隆得到了 VIN3 的 3 個同源基因：TmVIL1、TmVIL2 和 TmVIL3，水稻 Oryza sativa 中也獲得了 4 個 VEL 家族的基因：OsVIL1、OsVIL2、OsVIL3 和 OsVIL4，它們編碼的 蛋白均具有 PHD 結構域保守的 C4HC3 的基序特性。擬南芥和禾本科植物中的 VIN3/VEL 家族蛋白 都具有保守的 PHD 結構域， 這對認識 PHD-finger 蛋白功能及其在春化途徑中的作用是至關重要的。 根據(jù)擬南芥及其蕓薹屬相關領域的研究報道， 本試驗中重點針對開花網絡核心基因 FLC 及其春 化作用途徑上游的關鍵基因 VIN3 進行研究，首次從十字花科蕓薹屬作物結球甘藍中克隆了春化相 關基因 VIN3，通過生物軟件對 VIN3 基因進行了序列分析，并通過 RT-PCR 方法檢測在結球甘藍中 的表達情況及其與春化作用的關系，為研究結球甘藍綠體春化的分子機理提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 材料 以結球甘藍（Brassica oleracea L. var. capitata L.）中熟品種光榮 1 號為試驗材料，于日光 溫室播種育苗，幼苗長至 1 2 片真葉時分苗于 8 cm 8 cm 營養(yǎng)缽中，苗期常規(guī)管理。根據(jù)前期進 行的結球甘藍不同苗齡對低溫感應試驗的結果，在 13 片真葉莖粗小于（12.83 0.14）mm 時植株不 能感受低溫春化，所以選取 14 片真葉，莖粗大于（13.73 0.17）mm 的大小均勻一致的幼苗放入光 照培養(yǎng)箱中進行綠體春化處理。 低溫春化處理條件為日均 8 （晝 10 / 夜 6 ） ， 光照時間為 12 h， 光強 72 mol m-2 s-1。春化處理過程中每 4 d 取莖尖及靠近莖尖的嫩葉 0.1 g，立即用液氮冰凍，然 后轉移至80 冰箱中保存?zhèn)溆谩?6 期 趙榮秋等：結球甘藍春化相關基因 BoVIN3 的克隆及其表達分析 1101 1.2 RNA 提取和反轉錄 參照劉生財（2009）的方法提取結球甘藍莖尖總 RNA。以總 RNA 為模板，Oligo(dT)18為引物， 按照 RevertaidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit dNTP（10 mmol L-1）試劑盒（MBI 公司） 說明利用 M-MuLV 反轉錄酶進行反轉錄，獲得 cDNA 第一鏈。 1.3 結球甘藍 BoVIN3 的 PCR 擴增和測序 根據(jù)擬南芥 VIN3 基因的 mRNA 序列（NM-125121.3）的 ORF 編碼區(qū)，采用 Primer 5.0 軟件設 計引物。 正向引物為： 5-ATGCAAGCTGCTTCGCTCTCAAAGATCT-3， 反向引物為： 5-TTAATGCCA AAGCTTGAGGCAGAT-3，委托上海生工合成。PCR 分離結球甘藍 BoVIN3 的 ORF 編碼區(qū)序列。 反應體系為：4 L 模板，5 L 10 PCR Buffer，1 L 10 mmol L-1的 dNTP，正反向引物各 1 L，1 L Kod plus 酶， 加水至 50 L。 PCR 反應程序為 94 預變性 5 min； 94 變性 30 s， 55 退火 30 s， 68 延伸 2 min，35 個循環(huán)；72 10 min；4 10 min。PCR 擴增（1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測） ，目 的片段回收后連接在 pMD18T-Vector 上，轉化大腸桿菌 DH5 感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆委托上海 生工測序。 序列分析采用DNAMAN等工具軟件和NCBI上的BLAST （http： / blast. ncbi. nlm. nih. gov/ Blast. cgi）進行。 1.4 半定量 RT-PCR 檢測低溫處理及不同激素處理下 BoVIN3 的表達 應用 RT-PCR 技術對結球甘藍 BoVIN3 基因的表達進行半定量分析。 低溫處理過程中每 4 d 取莖 尖及靠近莖尖的嫩葉、第 8 9 節(jié)位的真葉、及此節(jié)位的莖桿用于 RNA 提取。激素處理時選取 14 片真葉的幼苗常溫條件下葉面噴施處理至葉片充分淋濕為止，為使溶液充分接觸葉片，在溶液中加 入 1 2 滴吐溫 20 。每 3 d 處理 1 次，共 3 次。具體處理方法如下：用 50、100 mg L-1的赤霉素 （GA3）和 20、80 mg L-1的激動素（KT）噴施處理。于處理當天和以后每 6 d 取莖尖及靠近莖尖 的嫩葉用于 RNA 提取。反轉錄，獲得 cDNA 第一鏈（同 1.2） ，以其為模板，使用結球甘藍 BoVIN3 基因的特異引物進行半定量 RT-PCR 反應， 引物為 BoVIN3-1F： 5-CCACGCATTGTCTAACCAGC-3， BoVIN3-1R： 5-GCACACTCCAAATGACAAGAC-3， BoVIN3-2F： 5-GAGTGTAAGTGAGAGGAGGG- 3，BoVIN3-2R：5-TTACGGTCAGGACGAGAGGT-3；以結球甘藍 Actin 基因為內標基因，ActinF： 5-CTGGTTTCGCCGGTGATGATGC-3， ActinR： 5-ATTTCCCGCTCGGCTGTGGTG-3； 反應體系為： 0.5 1 L 模板、 2.5 L 10 PCR Buffer、 1.5 L 25 mmol L-1的 Mgl2、 2.5 L 2 mmol L-1的 dNTP、 正反向引物各 1 L、0.1 L rTaq 酶，加水至 25 L。 1.5 半定量 RT-PCR 檢測低溫處理下 FLC 的表達 應用 RT-PCR 技術對結球甘藍 FLC 基因的表達進行半定量分析。以 1.4 中結球甘藍低溫春化處 理取樣后所提 RNA 反轉錄獲得的相同的 cDNA 為模板，使用結甘藍 FLC 基因的特異引物進行半定 量 RT-PCR 反應， 反應體系和內標基因同 1.4。 引物為 FLCF： 5-CGACAAGTCACCTTCTCCAAAC-3； FLCR：5-CGGAAGATTGTCGGAGATTTGT-3。 2 結果與分析 2.1 結球甘藍春化基因 BoVIN3 的克隆 根據(jù) GenBank 上公布的擬南芥 VIN3 基因序列設計特異性引物，以低溫春化處理 36 d 的結球甘 藍莖尖總 RNA 為模板，反轉錄獲得 cDNA 第一鏈進行 PCR 反應，擴增出相應的基因片段。擴增產 1102 園 藝 學 報 39 卷 物經 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 得到預期大小 的長為 1 700 bp 左右的目的條帶（圖 1） 。 回收產物，經連接轉化、測序，結果表明 從蕓薹屬植物結球甘藍中克隆了兩條 BoVIN3 基因，編碼區(qū)全長各 1 680 bp，GenBank 登錄 號分別為 JQ394927 和 JQ394928。 兩條基因核酸序列比對相似性達 87.58%， 氨基酸序列比對相似性達 82.70%， 命名為結球 甘藍 BoVIN3-1 和 BoVIN3-2。 2.2 結球甘藍春化基因 BoVIN3 的序列分析 在 NCBI 上 BLAST 表明，所克隆的基因 與擬南芥或蕓薹屬植物的春化相關基因 VIN3 具有較高的同源性。BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 與擬南芥 AtVIN3（accession number：NM_125121.3）在核酸水平上同源性分別達到 85.55%和 79.95%。其推 測的氨基酸序列與擬南芥 VIN3（Q9FIE3）的同源性分別達到 80.72%和 72.96%（圖 2）；與蕓薹屬 紅菜薹 VIN3（C4PFF9）分別達到 83.5%和 96.73%；與蔓田芥 VIN3（D6RRE9）分別達到 85.96%和 圖圖 2 不同植物不同植物 VIN3 氨基酸序列同源性比較氨基酸序列同源性比較 ：結球甘藍 VIN3-1（JQ394927） ；：結球甘藍 VIN3-2（JQ394928） ；：擬南芥（Q9FIE3） ；：紅菜薹（C4PFF9） 。 Fig. 2 Homology comparison of BoVIN3 cDNA in different plants ：Brassica oleracea var. capitata VIN3-1（JQ394927） ；：Brassica oleracea var. capitata VIN3-2（JQ394928） ； ：Arabidopsis thaliana（Q9FIE3） ；：Brassica rapa var. purpuraria（C4PFF9）. 圖圖 1 結球甘藍結球甘藍 BoVIN3 基因的基因的 RT-PCR 產物電泳圖產物電泳圖 M：DNA marker 5 000；1、2：目的基因。 Fig. 1 Electrophoresis of RT-PCR products of BoVIN3 in cabbage M：DNA marker 5 000；1，2：Target genes. 6 期 趙榮秋等：結球甘藍春化相關基因 BoVIN3 的克隆及其表達分析 1103 89.38%。結球甘藍 BoVIN3 與其它植物 VIN3 類蛋白部分氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明，BoVIN3-1 與擬南芥 VIN3 具有最高的同源性，BoVIN3-2 與蕓薹屬植物紅菜薹具有最高的同源性（圖 3） ，與其 他的 VIN3 類蛋白同源性相對偏低（30% 40%） 。與擬南芥和小麥中 VIN3 類蛋白序列比較表明，本 試驗中克隆的兩條基因其氨基酸序列中包括 VIN3 的 PHD 區(qū)域（圖 4） 。 圖圖 3 結球甘藍結球甘藍 BoVIN3 與其它植物與其它植物 VIN3 類蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育關系類蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育關系 Bo：結球甘藍；Br：紅菜薹；At：擬南芥；Ag：蔓田芥；PtPOP：毛果楊；Tm：小麥。 Fig. 3 Phyolgenetic relationships between Brassica oleracea var. capitata L. BoVIN3 and other VIN3 or VIN3-like proteins Bo：Brassica oleracea var. capitata；Br：Brassica rapa var. purpuraria；At：Arabidopsis thaliana； Ag：Arabis gemmifera；PtPOP：Populus trichocarpa；Tm：Triticum monococcum ssp. monococcum. 圖圖 4 不同植物不同植物 VIN3 類蛋白類蛋白 PHD 結構域氨基酸序列比對結構域氨基酸序列比對 Fig. 4 Alignment of PHD-finger domain among different plants VIN3 proteins 2.3 結球甘藍春化基因 BoVIN3 表達模式分析 通過半定量 RT-PCR 檢測了 BoVIN3 在結球甘藍各組織的表達及其與春化作用的關系，結果表 明，春化誘導結球甘藍 BoVIN3 基因表達。如圖 5 所示，BoVIN3-1，BoVIN3-2 只在有絲分裂活性區(qū) 域莖尖生長點中表達，而在真葉和莖中均不表達；當春化處理 32 d 時，BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 幾乎沒有表達，從 36 d 才開始出現(xiàn)轉錄，到 42 d 春化臨界期時表達已經達到比較高的豐度，隨后 1104 園 藝 學 報 39 卷 開始下降，BoVIN3-1，BoVIN3-2 具有相同的表達模式。用 50、100 mg L-1的赤霉素（GA3）和 20、 80 mg L-1的激動素（KT）噴施處理后，BoVIN3-1，BoVIN3-2 基因均不表達（圖 6） 。 圖圖 5 低溫處理下結球甘藍低溫處理下結球甘藍 BoVIN3 基因在莖尖生長點（基因在莖尖生長點（A） 、真葉（） 、真葉（B） 、和莖（） 、和莖（C）中的表達）中的表達 Fig. 5 Expression of Bo VIN3 in cabbage stem tip（A） ，） ，leaf（B）and stem（C）under low temperature treatment 圖圖 6 GA3處理（左）和處理（左）和 KT 處理（右）下結球甘藍處理（右）下結球甘藍 BoVIN3 基因在莖尖生長點中的表達基因在莖尖生長點中的表達 Fig. 6 Expression of BoVIN3 in cabbage stem tip under GA3（left）and KT（right）treatment a：50 mg L-1 GA3；b：100 mg L-1 GA3；c：20 mg L-1 KT；d：80 mg L-1 KT. 2.4 低溫春化過程中結球甘藍 FLC 基因的表達分析 研究結球甘藍低溫春化處理過程中 FLC 基因的表達模式，RT-PCR 擴增結果顯示其表達受春化 作用的抑制（圖 7） ，春化過程中 FLC 基因持續(xù)表達，當?shù)蜏靥幚?36 d 時表達量有所下降，隨春化 處理時間延長表達量逐漸減少并在春化臨界期時幾乎檢測不到。 VIN3 受誘導表達后， FLC 的表達受 到抑制，且 VIN3 基因的表達水平與低溫時間的長度和 FLC 的抑制程度成正比。說明植物在生長發(fā) 6 期 趙榮秋等：結球甘藍春化相關基因 BoVIN3 的克隆及其表達分析 1105 育過程中確保 FLC 的高表達來避免植物在還未完全積累物質能量時過早開花。 圖圖 7 低溫處理下結球甘藍低溫處理下結球甘藍 FLC 基因的表達基因的表達 Fig. 7 Expression of cabbage FLC under low temperature treatment 3 討論 結球甘藍屬于綠體春化型植物，幼苗需長到一定大小方能感應低溫通過春化，我們根據(jù)已報道 的種子春化型植物擬南芥春化相關基因 VIN3 設計引物， 通過 RT-PCR 方法首次從結球甘藍中克隆了 VIN3 春化相關基因，并對其表達特性進行初步研究。 序列分析表明，本試驗中克隆的春化相關基因 BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 與擬南芥或其它蕓薹屬植 物中相應基因具有很高的同源性。BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 與 AtVIN3 屬于同一基因，BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 包括 PHD 關鍵區(qū)域。PHD 鋅指結構域是 14 種已知的鋅指結構域中的一種，存在于 400 多種真核生物蛋白質中，在進化過程中高度保守（Kaadige & Ayer，2006） 。擬南芥和小麥 VIN3/VIL 類蛋白都含有 PHD 鋅指蛋白 C4HC3（Cys4-His-Cys3）的鋅結合基序（Fu et al.，2007） 。此結構域 涉及多種功能，包括蛋白質的甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等，BoVIN3 很有可能通過此區(qū)域作 用于 FLC。 本研究中發(fā)現(xiàn)，長時間 （大于 36 d） 的低溫春化處理會誘導結球甘藍 BoVIN3 的表達，并使 FLC 表達量降低，到達春化臨界期 42 d 時 BoVIN3 的表達量達到峰值，隨后下降。在模式植物擬南芥中 很早以前就有過這種現(xiàn)象的相關報道（Sung & Amasino，2004） ，經過春化處理后，F(xiàn)LC 染色質組蛋 白 H3K9、 H3K27 的二甲基化和三甲基化水平升高， 植株表現(xiàn)為早花。 該過程依賴于關鍵基因 VIN3， VIN3 具有感受低溫時程的特性。 冬性一年生擬南芥只有經過足以產生春化效應的一段時期的低溫處 理后，VIN3 才會被誘導表達，一般時間為 20 d（Sung & Amasino，2004） 。如處理時間不夠，VIN3 不會被誘導表達，也就不會產生下游的春化效應。當 VIN3 被誘導表達后，F(xiàn)LC 的表達隨即被抑制， 因而 VIN3 的作用是在春化過程中識別低溫處理的時間進而抑制對春化關鍵基因 FLC 的表達（趙仲 華 等，2006） 。 春化作用是一個低溫誘導體內特異基因表達的過程，RT-PCR 半定量分析表明，結球甘藍中春 化相關基因 BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 與擬南芥和其它蕓薹屬植物中的 VIN3 基因具有類似的表達模式 （李勇，2009） 。BoVIN3 在沒有春化處理之前沒有表達，春化處理之后具有較高水平的表達，這說 明 BoVIN3 在低溫冷處理條件才能被誘導。BoVIN3 編碼含有 PHD 結構域的蛋白，該區(qū)域可以參與 FLC 染色質上組蛋白的甲基化和去乙?；揎棧?從而調控 FLC 的轉錄水平， 使其表達處于較低狀態(tài) （Sung & Amasino，2004） 。FLC 是 MADS-box 轉錄因子，F(xiàn)LC 是開花抑制基因，春化處理之后， 由于 FLC 被抑制，最終促進植物提前開花，而 FLC 對開花的抑制效應與其表達量的多少呈正相關 （Scortecci et al.，2003） ，低溫處理之后，F(xiàn)LC 因為 VIN3 的誘導而被低溫抑制，其表達量進一步降 低，且隨低溫處理時間的增加其表達量逐漸降低，直至最后檢測不到，最終進一步促進甘藍春化啟 動。以上結果表明，在結球甘藍中存在春化誘導基因 BoVIN3，參與對 FLC 的后生性抑制，并且使 1106 園 藝 學 報 39 卷 得這種抑制通過細胞有絲分裂得以維持（Sung & Amasino，2005；Sung et al.，2006） 。 不同濃度 GA3和 KT 處理下該基因均檢測不到任何轉錄本，說明結球甘藍 BoVIN3 基因的啟動 子可能不包含激素響應元件，不受激素的誘導表達。GA3是通過激活開花決定基因 LFY 的啟動子， 加強 LFY 的轉錄活性，從而啟動開花（Miguel et al.，1998）。很多基因只有在特定的器官、發(fā)育特 定時期或受特定環(huán)境因子的誘導時才表達，在長時間的低溫條件下，結球甘藍 BoVIN3 基因才能在 有絲分裂活性區(qū)域莖尖生長點被誘導表達，說明結球甘藍 BoVIN3 屬于春化特異基因，只響應 低溫誘導而轉錄。 References Bastow R，Mylne J S，Lister C. 2004. Vernalization requires epigenetic silencing of FLC by histone methylation. Nature，427 (6970)：164167. Fu D，Dunbar M，Dubcovsky J. 2007. Wheat VIN3-like PHDfinger genes are up-regulated by vernalization. Mol Genet Genomics，277 (3)： 301313. Helliwell C A，Wood C C，Robertson M. 2006. The Arbidopsis FLC protein interacts directly in vivo with SOC1 and FT chromatin and is a part of a high-molecular-weight protein complex. The Plant Journal for Cell and Molecular Biology，46 (2)：183192. Hepworth S R，Valverde F，Ravenscroft D. 2002. Antagonistic regulation of flowering time gene SOC1 by CONSTANS and FLC via separate promoter motifs. The EMBO Journal，21 (16)：43274337. Kaadige M R，Ayer D E. 2006. The polybasic region that follows the plant homeodomain zinc finger 1 of Pf1 is necessary and sufficient for specific phosphoinositide binding. The Journal of Biological Chemistry，281 (39） ：2883128836. Kim S，Choi K，Park C. 2006. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4，encoding a C2H2-Type zinc finger protein，represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. Plant Cell，189 (11)：29852998. Liu Sheng-cai. 2009. Physiological-biochemical mechanism of vernalization and clone of related genes in broccoliPh. D. Dissertation. Harbin： Northeast Agricultural University. (in Chinese) 劉生財. 2009. 低溫誘導青花菜春化作用生理機制及相關基因克隆博士論文. 哈爾濱：東北農業(yè)大學. Li Yong. 2009. Study on vernalization-related genes in Brassica campestris ssp. chinensis L. var. utilis Tsen et Lee（Purple Flowering Stalk）and molecular mechanism of its flowering earlyM. D. Dissertation. Chongqing：Chongqing University. (in Chinese) 李 勇. 2009. 紅菜薹春化作用相關基因及其天然早花突變的分子機理研究碩士論文. 重慶：重慶大學. Michaels S D，Amasino R M. 1999. FLOWERING LOCUS C encodes a