基因克隆載體.ppt

第五章 基因克隆載體,1,基因克隆載體定義 通過(guò)不同途徑將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細(xì)胞且能在其中維持的DNA分子。也稱(chēng)DNA克隆載體。,2,1. 載體的功能 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件,3,2.必備條件 1、克隆位點(diǎn)(一個(gè)或多個(gè)) 2、能攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞: 能自我復(fù)制，或整入染色體隨受體細(xì)胞DNA復(fù)制而復(fù)制。 3、有用于選擇克隆子的標(biāo)記基因 4、安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細(xì)胞) 意義：基因工程隨載體系統(tǒng)的建立而興起，構(gòu)建新載體一直是基礎(chǔ)研究的優(yōu)先領(lǐng)域。,4,按克隆載體的來(lái)源分： 質(zhì)粒 病毒或噬菌體 質(zhì)粒與病毒或噬菌體DNA組成的 質(zhì)粒與染色體DNA片段組成的,分 類(lèi),5,第一節(jié) 質(zhì)粒克隆載體 定義： 以質(zhì)粒DNA為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的載體，適于原核和植物的基因轉(zhuǎn)移、建立基因組文庫(kù)和cDNA基因文庫(kù)。,6,一、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的性質(zhì),、組成與構(gòu)型 是染色體外裸露的雙鏈DNA分子（細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻、綠藻）,7,構(gòu)型：,l-DNA,oc-DNA,ccc-DNA,ccc,8,、分子大小： 100102 kb,9,、復(fù)制 特點(diǎn): 在宿主細(xì)胞內(nèi)； 單向； 質(zhì)粒和宿主細(xì)胞雙重遺傳系統(tǒng)控制,拷貝數(shù)（宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒與染色體數(shù)量之比值）,10,（）每種質(zhì)粒在其宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)相對(duì)穩(wěn)定 嚴(yán)緊控制型：1-數(shù)個(gè)拷貝；大質(zhì)粒 松馳控制型：10個(gè)以上拷貝；小質(zhì)粒。 經(jīng)氯霉素處理，宿主中質(zhì)粒大量擴(kuò)增（如ColE1拷貝數(shù)達(dá)3000個(gè)）。,11,（）質(zhì)粒復(fù)制的控制因素 cop基因：指令宿主合成阻遏物，當(dāng)質(zhì)粒復(fù)制到一定拷貝數(shù)時(shí)，阻遏物也合成積累，直到阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復(fù)制。,12,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,、質(zhì)粒的不親和性 (閱讀教程p88,新版p105:兩種解釋) 親和性質(zhì)粒：能在同一細(xì)胞中復(fù)制的幾種質(zhì)粒 不親和性（不相容性）質(zhì)粒：不能在同一細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒 任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中 意義：受體細(xì)胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒，最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒,14,、質(zhì)粒遷移（質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性）,（1）含tra基因合成細(xì)胞表面物質(zhì)（鞭毛） 質(zhì)粒DNA入受體細(xì)胞,革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒可分成兩大類(lèi)： 接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），含tra基因的質(zhì)粒，如F、Ti質(zhì)粒等 非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用，不含tra基因的質(zhì)粒，如Col、R的其它成員,15,（）遷移作用 某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由 bom 和mob 基因決定。 不含tra基因而含bom（ori）位點(diǎn)的質(zhì)粒，當(dāng)宿主細(xì)胞存在輔助質(zhì)粒mob基因產(chǎn)物時(shí)，即可打開(kāi)ori位點(diǎn)，非結(jié)合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細(xì)胞。這種現(xiàn)象稱(chēng),16,、顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒,顯性（表達(dá)型）質(zhì)粒宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，這種質(zhì)粒稱(chēng)為顯性質(zhì)粒； 隱蔽質(zhì)粒即使宿主內(nèi)含有某種質(zhì)粒，但無(wú)異樣性狀表露，這種質(zhì)粒稱(chēng)為隱蔽質(zhì)粒,17,顯性質(zhì)粒 質(zhì)粒：含有氨芐青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四環(huán)素Tc、鏈霉素Sm等藥物的抗性基因，可作為選擇標(biāo)記。 Col質(zhì)粒 質(zhì)粒 降解質(zhì)粒 i質(zhì)粒 隱蔽質(zhì)粒 藍(lán)藻內(nèi)源質(zhì)粒,18,二、 質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建的基本策略 、能進(jìn)行有效復(fù)制復(fù)制起始位點(diǎn)（最好是多拷貝） 、克隆位點(diǎn)組裝MCS連桿 、選擇標(biāo)記基因抗性基因，Lac Z基因 、分子盡可能?。ㄞD(zhuǎn)化率高） 15kb，轉(zhuǎn)化率 、組裝各種“元件”，如啟動(dòng)子、終止子等,19,三、質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建 過(guò)程：嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建（切割、修飾和連接重組） 構(gòu)建原則 1、選用合適的出發(fā)質(zhì)粒：含必備的元件，如ori、選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)、啟動(dòng)子和終止子 2、正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的元件 3、組裝合適的選擇標(biāo)記基因 4、選用合適的啟動(dòng)子 5、構(gòu)建過(guò)程力求簡(jiǎn)單,20,代表性實(shí)例 （一）pBR322及其衍生質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建 、pBR322構(gòu)建 質(zhì)粒載體命名法則 “pBR322” p：質(zhì)粒（plasmid ) BR：兩位主要構(gòu)建者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首 322：實(shí)驗(yàn)編號(hào),21,22,pBR322構(gòu)建過(guò)程(出發(fā)質(zhì)粒：pMB1),23,pBR322的三個(gè)親本：pMB1、pSF2124、pSC101 識(shí)別位點(diǎn)： Apr基因區(qū)（3個(gè) ）： Pst、Sca 、Pvu Tcr基因區(qū)（7個(gè) ）：BamH 、Scal 、EcoR、 Sph 、Nhe 、Nru 、Xma Tcr啟動(dòng)子區(qū)（2個(gè) ）：Cla 、Hind pBR322分子大?。?363bp,24,25,26,優(yōu)點(diǎn): （1）較小的分子量 10kb以?xún)?nèi)DNA分子純化過(guò)程中可避免斷裂，pBR322易于自身純化，且可克隆6kb左右的外源DNA （2）帶有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn) 保證了該質(zhì)粒只在大腸桿菌的細(xì)胞中行使復(fù)制的功能。 （3）較高的拷貝數(shù) 經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)培后達(dá)10003000 copys/cell，該特性為重組體DNA的制備提供了極大的方便 （4）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。插入失活（圖解）,27,28,、pUC18/19質(zhì)粒載體 命名pUCUniversity of California的科學(xué)家首先構(gòu)建。 與pBR322區(qū)別： 乳糖操縱子的一個(gè)DNA片段（lac Z基因）替換Tcr基因； 組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）連桿,29,pUC包括四個(gè)組成部分： （1）pBR322的復(fù)制起點(diǎn)(ori) （2）Apr基因，但DNA序列發(fā)生變化，不再含原來(lái)限制性核酸內(nèi)切識(shí)別位點(diǎn) （3）lacZ基因 （4）在lacZ基因內(nèi)部靠近5端有一段MCS連桿,30,31,pBR322衍生的質(zhì)粒 缺失bom位點(diǎn) pBR325、 pBR327， pAT153，不具被動(dòng)遷移作用，更安全,32,Lac Z篩選機(jī)制： 含乳糖操縱子的啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)因子和 -半乳糖苷酶的N端146殘基(-肽) 合成有活性的 基因（lac Z）的質(zhì)粒載體+可編 -半乳糖苷酶 碼C端部分殘基的宿主(與Lac Z互補(bǔ) 的大腸桿菌) 在含IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）和 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖） 藍(lán)色菌落 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng) 在N端-肽的編碼區(qū)插入MCS 不影響lac Z基因功能 插入外源DNA 滅活lac Z基因 白色菌落,33,編碼b-半乳糖苷酶,IPTG,X-gal,(酶的底物),lac promoter,藍(lán)色菌落,IPTG可誘導(dǎo)lacZ形成肽鏈,該產(chǎn)物能與有缺陷的宿主細(xì)胞所編碼的C-末端發(fā)生基因內(nèi)互補(bǔ)，形成有活性的-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。 當(dāng)外源基因DNA片段插入多克隆位點(diǎn)后, 使其編碼的肽鏈?zhǔn)セ钚? 使其不能形成-互補(bǔ), 因此帶有外源基因重組子的細(xì)菌形成白色菌落。,34,重組子的顯色互補(bǔ)篩選法,35,-互補(bǔ)的原理,所謂基因內(nèi)互補(bǔ)作用，在LacZ體系中,是指二個(gè)彼此互補(bǔ)的突變基因（突變體1只含LacI和LacZ的N端145個(gè)氨基酸的肽；突變體2缺乏LacZ的N端肽），它們編碼產(chǎn)生的無(wú)活性的多肽產(chǎn)物，但由于二個(gè)突變體之間通過(guò)肽互補(bǔ)作用可呈現(xiàn)有功能的-半乳糖苷酶活性, 進(jìn)而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）而產(chǎn)生半乳糖和深藍(lán)色的底物5-溴-4-氯-青定藍(lán), 使菌落呈現(xiàn)出藍(lán)色反應(yīng)。然而，當(dāng)外源基因DNA片段插入載體中LacZ 肽區(qū)段的多克隆位點(diǎn)后, 就會(huì)阻斷序列的讀碼結(jié)構(gòu), 使其編碼的肽失去活性, 使重組子所在的細(xì)菌不能完成-互補(bǔ), 因此帶有外源基因重組子的細(xì)菌形成白色菌落。根據(jù)這種-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，可以檢測(cè)和篩選出攜有外源基因重組子克隆。此法又稱(chēng)藍(lán)白篩選法。如圖,非重組質(zhì)粒: 不含有插入的 DNA藍(lán)色菌落 重組質(zhì)粒: 含有插入的 DNA: 白色菌落,非重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒,37,38,pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) （1）分子量更小、拷貝數(shù)更高 （2）免疫組化法一步實(shí)現(xiàn)篩選鑒定重組體，省時(shí) （3）MCS區(qū)方便轉(zhuǎn)移外源DNA在不同載體系列中 “穿梭”，使具有兩種不同粘末端的外源DNA 能直接克隆入pUC載體,39,（二）藍(lán)藻質(zhì)粒克隆載體pPKE2的構(gòu)建 大腸桿菌質(zhì)粒不能轉(zhuǎn)化藍(lán)藻 藍(lán)藻內(nèi)的質(zhì)粒屬隱蔽質(zhì)粒 即：大腸桿菌源質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn) + 藍(lán)藻源質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn) pPbs（1511bp） pPbs Cla 重組 pPRS-1 多次亞克隆 pPKE2 pBR322 組裝CaMV35s啟動(dòng)子、MCS、rbcS終止子、Kmr基因,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒,40,41,（三）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建 Ti質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌中引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤（冠癭瘤）的質(zhì)粒，故稱(chēng)Tumor inducing plasmid（Ti質(zhì)粒）。 雙鏈環(huán)狀DNA分子，200250kb。,42,1、4個(gè)功能區(qū)：T-DNA區(qū)、Vir區(qū)、Con區(qū)、Ori區(qū) （1）T-DNA區(qū) Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的只有約25kb部分，即T-DNA（transfer DNA)。左右邊界各有一個(gè)25bp正向重復(fù)序列（LTS和RTS）稱(chēng)為邊界序列，為T(mén)-DNA的轉(zhuǎn)移和整合所必需。只要保留T-DNA的邊界序列，中間序列被外源DNA片段替換，仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中。 這是Ti質(zhì)粒用于遺傳轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)。,43,（2）Vir區(qū) 位于T-DNA區(qū)上游，其表達(dá)產(chǎn)物可激活T-DNA的轉(zhuǎn)移，顯示致瘤性。 （3）Con區(qū) 含有農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因（tra)，可受宿主產(chǎn)生的冠癭堿活化，使Ti質(zhì)粒在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，也即接合轉(zhuǎn)移基因編碼區(qū)。 （4）Ori區(qū) 復(fù)制起始區(qū)，調(diào)控Ti質(zhì)粒自我復(fù)制。 Ti質(zhì)?？寺≥d體真正用于植物而非農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌只起中介作用。,44,Ti質(zhì)粒作為載體的問(wèn)題 i) 太大，無(wú)適合克隆位點(diǎn) ii)T-DNA的存在不能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為完整植株 故不能達(dá)到直接選育轉(zhuǎn)基因植物的目的,45,2、構(gòu)建途徑 （1）取代型載體 用大腸桿菌質(zhì)粒克隆載體取代Ti質(zhì)粒的全部或部分T-DNA序列而構(gòu)建。外源基因以同源交換而重組。 Onc- Ti：T-DNA上的onc基因被取代而構(gòu)建。 Onc+ Ti：pBR322取代 T-DNA的部分序列但保留onc基因而構(gòu)建。進(jìn)入植物細(xì)胞誘發(fā)冠癭瘤。,46,（2）中間質(zhì)?？寺≥d體 將T-DNA的部分序列插入大腸桿菌質(zhì)粒載體而構(gòu)建。 共整合克隆載體系統(tǒng)（T-DNA同源序列、bom 位點(diǎn)） 雙元克隆載體系統(tǒng)微型Ti質(zhì)粒,47,（四）乳酸桿菌質(zhì)粒克隆載體 乳酸桿菌：G+，非致病，益生菌，用于食品和飲料。 乳酸桿菌質(zhì)粒：小質(zhì)粒，宿主范圍廣泛，可用于其它G+菌及大腸桿菌。 乳酸桿菌質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建： 用于其它G+菌及大腸桿菌; 乳酸桿菌本身對(duì)km、Ap抗性較強(qiáng)。 標(biāo)記基因： 選用lacZ，如有pLJ1復(fù)制啟始位點(diǎn)的pBG10 選用ery，如有p353-2復(fù)制啟始位點(diǎn)的pP3537,48,（五）酵母2m質(zhì)?？寺≥d體 幾乎所有釀酒酵母中都存在,（1）2m質(zhì)粒結(jié)構(gòu) a、環(huán)狀分子內(nèi)有反向重復(fù)序列IR1和IR2，可發(fā)生重組，形成A、B型質(zhì)粒；有ori復(fù)制起始點(diǎn)能自主復(fù)制。,圖3-10 A型酵母2m質(zhì)粒,b、2080個(gè)/細(xì)胞。有絲分裂時(shí)數(shù)目穩(wěn)定，減數(shù)分裂時(shí)形成cir+/cir0,49,（2）YEp克隆載體（酵母游離型質(zhì)粒） 2m質(zhì)粒的ori EcoR酶切 pBR322質(zhì)粒 酵母染色體URA3基因Hind酶切 YEp24,50,特征 （1）保留了pBR322的和篩選大腸桿菌克隆子 （2）含URA3標(biāo)記篩選酵母菌克隆子 （3）URA3基因補(bǔ)償酵母菌ura3突變 優(yōu)點(diǎn) （1）是一種穿梭質(zhì)粒，可在酵母菌和大腸桿菌中復(fù)制 （2）轉(zhuǎn)化率高，1gDNA可獲得約104105個(gè)克隆子 （3）穩(wěn)定高拷貝復(fù)制 故可用酵母菌高水平表達(dá)外源目的基因,51,（六）TA克隆載體針對(duì)PCR產(chǎn)物的克隆,故可研制一種線性載體，其5端各帶一不配對(duì)T，可直接與PCR產(chǎn)物以TA連接進(jìn)行克隆，即TA克隆。,原理 PCR產(chǎn)物在Taq酶的非模板依賴(lài)活性作用下，于3端加一非配對(duì)的A。,52,53,TA克隆,54,2019/10/26,55,TA載體的再生方法 （1）克隆載體線性化 （2）克隆載體末端補(bǔ)平反應(yīng) （3）克隆載體末端加T反應(yīng) 注：再生后的TA載體，原線性化的酶切位點(diǎn)消失,56,5-GGCTGGCTGG NNNCAGGTATATTGNNNNGTAAAC AAATTGACGC-3,LB,5-TATCAGTGGT GACAGGATATATTGGCGCGTAAAC AAATTGACGC-3,RB,圖 T-DNA的LTS核苷酸序列（LB）和RTS核苷酸序列（RB）,57,MCS連桿,58,第二節(jié) 病毒（噬菌體）克隆載體,病毒基本結(jié)構(gòu)： DNA（或RNA）+ 外殼蛋白 感染細(xì)菌的病毒，稱(chēng)為噬菌體 分類(lèi)（根據(jù)病毒與宿主的關(guān)系） 溫和性病毒： 溶原性增殖構(gòu)建病毒載體 烈性病毒： 溶菌性增殖改造后,59,一、噬菌體克隆載體,（一） 噬菌體性質(zhì) DNA + 外殼蛋白 1、DNA (48.5kb) 噬菌體中：線性 宿主細(xì)胞：環(huán)狀(cos位點(diǎn)),60,2、噬菌體基因組有基因50個(gè)以上,J與N、P與Q之間為非必需序列,61,3、 限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn): 56種（p477） 4、 噬菌體的生長(zhǎng)途徑 溶菌生長(zhǎng)途徑 溶原生長(zhǎng)途徑宿主合成int基因產(chǎn)物-DNA整合到染色體DNA上 某種脅迫條件下合成six基因產(chǎn)物-DNA脫離細(xì)菌染色體溶菌,62,（二）構(gòu)建依據(jù) 1、噬菌體是一種溫和噬菌體 2、能承載較大的外源DNA片段 野生型DNA頭部可包裝約36.451kb(自身的75%105%)，且約有20kb DNA可缺失（生長(zhǎng)非必需） 3、在DNA上有多種限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn),63,（三）構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線 策略: 切去部分非必需區(qū) 刪掉多余的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn) 插入選擇性標(biāo)記基因 建立體外包裝系統(tǒng),64,技術(shù)路線 1、用限制性酶切去非必需區(qū)，抹去多余識(shí)別位點(diǎn) 選定一種酶，以gtWES 為例，EcoRI （48.5kb） DNA E co R I 6個(gè)片段,65,B片段是噬菌體生長(zhǎng)非必需的； C片段缺失可阻斷溶原生長(zhǎng)途徑，但不影響溶菌途徑； E片段去掉min5序列（2.6kb）。 兩端EcoR I別點(diǎn)經(jīng)點(diǎn)突變或甲基化處理，即得gtWES：（48.5-5.5-2.6 = 40.4kb） 克隆能力： 替換B： 最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb 最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 實(shí)際應(yīng)用時(shí)克隆能力略有出入（p109,表3-5）,66,2、在DNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因 （1）自然篩選（51kb或36.4kb不能包裝） （2）插入選擇標(biāo)記基因 取代red和gam基因 野生型噬菌體(Spi+表型) 在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中不能生長(zhǎng) （red、gam基因） 外源DNA取代 獲Spi-表型 在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中能生長(zhǎng) red、gam基因 局限性：只能以P2噬菌體溶原細(xì)胞作為受體 最常用的篩選標(biāo)記：Lac Z基因,67,3、建立重組DNA分子體外包裝系統(tǒng) 體外重組DNA分子必須經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后，才能轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞。 野生型噬菌體感染的細(xì)胞中無(wú)多余的外殼蛋白。( 見(jiàn)教材解釋?zhuān)盒掳鎝115) D-（D基因缺失噬菌體）受體細(xì)胞積累除D蛋白以外所有蛋白質(zhì) E-（E基因缺失噬菌體）受體細(xì)胞積累除E蛋白以外所有蛋白質(zhì) 混合 D、E互補(bǔ) 包裝DNA分子 噬菌體 如:菌株BHB2688(E- )+ BHB2690(D-),68,（四） 噬菌體克隆載體的應(yīng)用 1、建立c DNA基因文庫(kù) 轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過(guò)程。效率高。 轉(zhuǎn)染(transfection) 指真核細(xì)胞主動(dòng)或者被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA 片段而獲得新表型的過(guò)程。 2、克隆外源目的基因,69,（五）重組DNA分子的體外包裝（自學(xué)）,1、溶原菌BHB2688(E- )和BHB2690(D-)的檢驗(yàn) 2、制備包裝物 3、體外包裝,70,（一）構(gòu)建策略 由質(zhì)粒和含cos位點(diǎn)的DNA片段組裝成的載體，即cosmid克隆載體,又叫粘粒; 或：cosmid克隆載體是一類(lèi)帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質(zhì)粒DNA分子。是噬菌體質(zhì)粒混合物。,二、cosmid克隆載體（柯斯質(zhì)粒載體）,71,（二） cosmid的特征 (教材新版p118) 1、環(huán)形雙鏈DNA分子, 36.4kb, 一般10kb 2、具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并按質(zhì)粒方式復(fù)制 3、含有一個(gè)cos位點(diǎn) A蛋白 cos末端體外包裝成為噬菌體，但不含噬菌體溶菌生長(zhǎng)途徑、溶原生長(zhǎng)途徑和DNA復(fù)制系統(tǒng)，不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體,72,4、cosmid較小，可承載更大的外源DNA 若cosmid為6.5kb，則可承載44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。 因此，cosmid克隆廣泛用于構(gòu)建基因組文庫(kù)。,73,（三）柯斯克隆(Cosmid cloning),(1)定義 應(yīng)用柯斯質(zhì)粒作載體，在大腸桿菌寄主細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組DNA的技術(shù)，叫做柯斯克隆。 這個(gè)定義的三個(gè)要點(diǎn)是： a.柯斯質(zhì)粒作載體； b.大腸桿菌為寄主; c.克隆大片段的真核基因組DNA。,74,（2）理論依據(jù),a.在phage線性DNA分子的每一端都具有彼此互補(bǔ)的單鏈突出序列，即所謂的粘性末端(cos位點(diǎn)) b.phage的多連體分子是由cos連接而成的。 cos cos cos cos cos cos c.末端酶(treminase)或叫Ter體系即phage具有一種位點(diǎn)特異的切割體系(site-specific cutting system).A蛋白 *此系統(tǒng)能識(shí)別兩個(gè)相距適宜的(36.451kb)cos位點(diǎn)，并切割之。 *根據(jù)上述分析可知phage DNA包裝的兩個(gè)必要條件是：cos位點(diǎn)、Ter體系（A蛋白）,75,（3）柯斯質(zhì)粒包裝條件,由于只有在被作用的DNA分子具有兩個(gè)cos位點(diǎn)，而且它們之間距離保持在36.451kb的條件下，Ter體系才能對(duì)它發(fā)生作用。 據(jù)此推斷： 柯斯質(zhì)粒是不能作為包裝體系的，因?yàn)樗挥幸粋€(gè)cos位點(diǎn)。 因此：柯斯質(zhì)粒只有在同適當(dāng)大小的外源DNA片段重組成具有兩個(gè)cos位點(diǎn)而且相距達(dá)36.451kb之間時(shí)，才能被包裝。(見(jiàn)應(yīng)用新版p119),76,利用Cos質(zhì)粒進(jìn)行克隆,77,（四）使用cosmid載體的基本程序 利用cosmid的質(zhì)粒性質(zhì)，可按質(zhì)粒操作轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 利用cosmid的噬菌體性質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞（下圖）,78,三、M13噬菌體克隆載體（單鏈絲狀噬菌體載體 ）,79,含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源DNA的位點(diǎn),（一）M13 DNA 環(huán)狀單鏈DNA分子（“+”鏈DNA） 大?。?.4kb 結(jié)構(gòu)：10個(gè)區(qū) 基因間隔區(qū)（IS區(qū)）,80,（二）M13DNA復(fù)制和M13噬菌體增殖 M13 DNA“+”鏈進(jìn)入雄性大腸桿菌 合成“-”鏈產(chǎn)生雙鏈M13 DNA復(fù)制型DNA(RF-DNA 按環(huán)狀雙鏈DNA方式復(fù)制，同時(shí)以“+”鏈DNA為模板轉(zhuǎn)譯包裝蛋白 RF-DNA達(dá)200拷貝時(shí)，單鏈DNA特異結(jié)合蛋白與“+”鏈結(jié)合而阻斷合成“-”鏈 結(jié)果只能以“-”鏈為模板合成“+”鏈 “+”鏈DNA被包裝蛋白包裝成新的M13噬菌體 擠出受體細(xì)胞 受體細(xì)胞不被溶菌。,81,82,83,M13 DNA復(fù)制特征：以雙鏈DNA為中間媒介 培養(yǎng)物高速離心上清中含噬菌體顆?！?”鏈DNA 沉淀菌體破碎后，可提取RF-DNA,84,（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑 策略：在RF-DNA的IS區(qū)插入選擇標(biāo)記基因，并組裝合適 RF-DNA上有10個(gè)BsuI位點(diǎn)部分酶切獲得全長(zhǎng)線形RF-DNA, 與含LacZ標(biāo)記的Hind酶切片段進(jìn)行平末端連接M13mp1載體。為獲得合適的克隆位點(diǎn),可在Lac Z區(qū)插入連桿 構(gòu)建成對(duì)M13載體，保證外源DNA兩條鏈都能隨“+”鏈一起復(fù)制包裝。,85,86,（四）M13克隆載體的優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用 優(yōu)點(diǎn)： 1、以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介復(fù)制，可與質(zhì)粒一樣體外純化操作 2、制備的M13 DNA單、雙鏈都能轉(zhuǎn)化大腸桿菌，直接轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 3、單鏈DNA不受包裝限制，可包裝M13 DNA分子6倍的DNA分子 4、可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA插入的單鏈DNA分子 主要用途：克隆、分離單鏈外源DNA片段 獲得的“+”鏈可直接用于DNA測(cè)序,87,MCS連桿,88,89,90,91,第三節(jié) 染色體定位整合克隆載體,質(zhì)粒與病毒克隆載體的不足： 1、外源DNA的不穩(wěn)定性 2、外源DNA插入染色體DNA位點(diǎn)的隨機(jī)性,92,基因整合平臺(tái)系統(tǒng)基因定位同源重組(基因打靶) 整合平臺(tái)：即受體細(xì)胞基因組上給定的DNA區(qū)域，是外源DNA 定位整合的位置 定位整合克隆載體：除一般質(zhì)?？寺≥d體必備的元