高效液相色譜.ppt

第七章 高效液相色譜法,第一節(jié) 概述,一、史程、專(zhuān)用術(shù)語(yǔ),二、色譜分離過(guò)程和類(lèi)型,液固吸附色譜,液液分配色譜,離子交換色譜,離子對(duì)色譜,空間排阻色譜,三、色譜流程和儀器,四、HPLC的特點(diǎn),速度快，分辨率高，靈敏度高、柱子可反復(fù)使用,第二節(jié) 基本理論,一、色譜分離過(guò)程,（一）液-固吸附色譜,流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑，根據(jù)物質(zhì)吸 附作用的不同來(lái)分離物質(zhì)。,流動(dòng)相和固定相都是液體的色譜法即為液-液 色譜，是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間 的分配來(lái)進(jìn)行分離。一種液相為流動(dòng)相，另一 種是涂漬于載體上的固定相。,（二）液-液分配色譜,流動(dòng)相極性小于固定相極性的液-液色譜法稱(chēng)為正相 分配色譜法,流動(dòng)相極性大于固定相極性的液-液色譜法稱(chēng)為反相 分配色譜法,（三）離子交換色譜,（四）離子對(duì)色譜法,（五）分子排阻色譜法,二、色譜流出曲線(xiàn)和保留值,（一）色譜流出曲線(xiàn)及相關(guān)術(shù)語(yǔ),（二）保留值,三、分離度,第三節(jié) 定性和定量分析,一、定性分析,（一）利用已知物對(duì)照法定性,1、利用保留特性,2、利用不同柱比較,（二）色譜法和其他方法結(jié)合定性,1、利用化學(xué)反應(yīng)定性,2、利用二極管陳列檢測(cè)器,3、收集峰的流出物,4、HPLC-MS,二、定量分析,（一）峰面積或峰高的測(cè)量方法,1、手測(cè)峰高,2、峰高乘半峰寬,3、剪紙稱(chēng)重,4、積分儀測(cè)定,5、微處理機(jī)測(cè)定,（二）定量方法,1、峰面積歸一法,2、外標(biāo)法,3、內(nèi)標(biāo)法,4、內(nèi)加法（或追加法）,第四節(jié) 高效液相色譜的分離模式,一、基本原理,二、分類(lèi),1、吸附色譜,2、分配色譜,3、離子交換色譜,4、分子排阻色譜,5、親和色譜,三、HPLC在生物大分子中的應(yīng)用,在生物大分子中的HPLC中，體積排阻色譜，離 子交換、反相液相和親和色譜是最常用的分離 模式。,第五節(jié) 液-固色譜法,液-固色譜法通常稱(chēng)為吸附色譜,1、載體：硅膠,2、吸附劑吸附試樣的能力,3、原理,第六節(jié) 鍵合相色譜法,一、正相色譜法,1、在正相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的基團(tuán) 都是極性基團(tuán)。,2、分離機(jī)制屬于分配色譜,3、主要用于分離極性不同的化合物，特別是 用來(lái)分離不同類(lèi)型的化合物。,二、反相色譜,1、分離機(jī)理,2、固定相,3、流動(dòng)相,第七節(jié) 離子交換色譜,離子交換色譜是以離子交換樹(shù)脂作為固定相， 樹(shù)脂上具有固定離子基團(tuán)及可交換的離子基團(tuán)， 當(dāng)流動(dòng)相帶著組分電離生成的離子通過(guò)固定相時(shí)， 組分離子與樹(shù)脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆交 換，根據(jù)組分離子對(duì)樹(shù)脂親和力不同而得到分離。 按結(jié)合的基團(tuán)不同，離子交換樹(shù)脂可分為陽(yáng)離子 交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂。,種類(lèi),陽(yáng)離子交換樹(shù)脂,強(qiáng)酸性,弱酸性,陰離子交換樹(shù)脂,強(qiáng)堿性,弱堿性,離子交換層析適用性,能在水溶液或含水極性溶劑中產(chǎn)生游離離子基團(tuán)的酸、堿及兩性成分?？捎糜诎被?、肽類(lèi)、生物堿、有機(jī)酸、酚類(lèi)等水溶性成分的分離。,使用離子交換劑使物質(zhì)分離表 樣品 強(qiáng)酸型(磺酸型) 稀NH4OH洗脫 通過(guò)液 酸性、中性化合物 解離型、兩性化合物 稀NaOH洗脫 強(qiáng)堿型(季銨型) 強(qiáng)堿型 稀HCl洗脫 通過(guò)液 通過(guò)液 酸性化合物 中性化合物 解離型物質(zhì) 兩性化合物 (鹽、生物堿),一、離子交換色譜的分離機(jī)理,1、,不足之處：忽略了在填料表面上形成復(fù)合物時(shí) 溶質(zhì)被流動(dòng)相中小分子飽和并不斷進(jìn)行計(jì)量置 換反應(yīng)的重要因素。,2、,P0：流動(dòng)相中溶質(zhì)的濃度,Pb：填料表面上被吸附的溶質(zhì)濃度,D0：流動(dòng)相中洗脫劑的濃度,Db：填料表面上洗脫劑的濃度,Z：是蛋白質(zhì)在吸附過(guò)程中從填料表面上被置換的 洗脫劑的數(shù)目。, Z可以小到忽略不計(jì)，反應(yīng)常數(shù)變?yōu)榉峙湎禂?shù), 在Z值不能忽略時(shí),在等度洗脫蛋白質(zhì)的過(guò)程中，容量因子K與保留 體積成比例，同時(shí)洗脫過(guò)程中，Kd， Db是常數(shù)， 用Kz表示。,3 結(jié)論,二、離子交換色譜的固定相,1、高分子類(lèi)型填料, 優(yōu)點(diǎn),a填料的使用壽命長(zhǎng),b具有較高的色譜容量,c 很少有非特異性吸附，對(duì)于保持樣品生物活性 有利。, 結(jié)構(gòu),以交聯(lián)共聚的苯乙烯-二乙烯苯為基質(zhì)，同時(shí) 也出現(xiàn)了許多其他交聯(lián)高聚物基質(zhì)的固定相。, 類(lèi)型,Mono Beads,TSK-gel DEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW,2、無(wú)機(jī)基質(zhì)型,三、離子交換色譜的流動(dòng)相,1、流動(dòng)相的PH值, 離子交換容量受流動(dòng)相的PH值影響, 改變流動(dòng)相PH值，也會(huì)影響弱電離的酸 性或堿性組分的電離情況，因而改變組分的 保留值。,流動(dòng)相PH值的變化也能改變分離的選擇性, 對(duì)流動(dòng)相PH值的控制，通常采用緩沖溶液 來(lái)實(shí)現(xiàn)。,2、流動(dòng)相的離子強(qiáng)度,四、離子交換色譜的影響因素,1、填料孔徑的影響,2、柱長(zhǎng)的影響,3、流速的影響,4、PH值的影響,無(wú)論在強(qiáng)的還是弱的陰離子交換柱上，蛋白質(zhì) 均顯示不同PH值影響結(jié)果，因此決定了它的保 留選擇性、分離度和回收率等因素。,5、離子強(qiáng)度的影響,第八節(jié) 體積排阻色譜法,一、分離機(jī)理,1、體積排阻色譜法（SEC） 或空間排阻色譜法（SEC） 或凝膠色譜法,2、凝膠過(guò)濾色譜法（GFC）,Sephadex 葡聚糖凝膠,3、凝膠滲透色譜法（GPC）,4、空間排斥理論,V0 死體積，相當(dāng)于凝膠的粒間體積,Vs 色譜柱中凝膠的孔穴總體積,二、體積排阻色譜法的特點(diǎn),三、體積排阻色譜法的固定相,（一）固定相的分類(lèi),1、按固定相基質(zhì)分類(lèi),2、按固定相機(jī)械強(qiáng)度分類(lèi),（二）凝膠固定相的特性參數(shù),1、滲透極限,2、分離范圍,3、固流相比,在SEC中常將柱中凝膠孔體積中的溶劑稱(chēng)為 固定相，而將柱中凝膠顆粒間空隙體積中稱(chēng)為 流動(dòng)相，而凝膠孔體積與凝膠顆粒間空隙體積 的比值稱(chēng)作固流相比。,4、柱效,（三）凝膠色譜柱的制備及譜圖的特點(diǎn),物理因素影響凝膠色譜柱的性能, 擴(kuò)大分離范圍使用兩根以上的串聯(lián)色譜 柱。,更換流動(dòng)相,譜圖的特點(diǎn)：在凝膠滲透色譜中，對(duì)不同分子量 聚合物色譜峰的譜帶展寬不同于其它液相色譜。, 在低效排租色譜法，樣品分子大小隨V的增加 而急劇減小，而柱效卻隨樣品分子量的增加而增 大因此在色譜圖上，不同分子量組分的譜帶寬度 保持不變。, 在高效排租色譜法，峰寬卻是個(gè)變量。,四、體積排租色譜法的流動(dòng)相,在體積排租色譜法中，流動(dòng)相的性質(zhì)對(duì)保留值 和分離選擇性無(wú)影響。, 溶解樣品的良溶劑, 低黏度溶劑, 柱填料不能在溶劑作用下收縮或溶脹, 控制流動(dòng)相的PH值和離子強(qiáng)度, 凝膠滲透色譜示差折光檢測(cè)器 流動(dòng)相的折射率必須盡可能與樣品的折射率 有較大的差別。 凝膠過(guò)濾色譜紫外吸收檢測(cè)器 使用在檢測(cè)波長(zhǎng)無(wú)紫外吸收的溶劑作流動(dòng)相。,（一）凝膠滲透色譜的流動(dòng)相,凝膠滲透色譜常采用甲苯，四氫呋喃和氯仿等 有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。,在用于高聚物分子量測(cè)定的凝膠滲透色譜中， 四氫呋喃是最常用的流動(dòng)相，它對(duì)樣品有良好 的溶解性能和低的黏度，并可使小孔徑聚苯乙烯凝膠溶脹，因此被優(yōu)先推薦使用。,（二）凝膠過(guò)濾色譜的流動(dòng)相,在凝膠過(guò)濾色譜中，使用以水作基體具有不同 PH值的多種緩沖溶液作流動(dòng)相。,五、體積排租色譜的影響因素,1、填料, 化學(xué)鍵合的硅膠, 親水樹(shù)脂凝膠,2、柱長(zhǎng),體積排租色譜的分離度與柱長(zhǎng)的平方根成正比。,3、洗脫液, 以硅膠為基質(zhì)的填料，PH值范圍在2.0-8.0。, 鍵合硅膠如TSK系列凝膠柱在分離蛋白質(zhì)時(shí) 保留時(shí)間主要取決于填料表面上的硅醇基與離 子的反應(yīng)。,a) 洗脫液離子強(qiáng)度低時(shí),b) 洗脫液離子強(qiáng)度低增加到0.3-0.5mol/L,c) 常用磷酸鹽和硫酸鹽進(jìn)行離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié),d) 用氯化鈉作離子劑，疏水作用最小,e) PH值不能太低，因?yàn)镠+會(huì)腐蝕不銹鋼柱,4、流速,蛋白質(zhì)分離時(shí)，流速對(duì)分離度的影響是一個(gè)很 重要的因素，一般在低流速下蛋白質(zhì)分離是比 較理想。,5、樣品容量,進(jìn)樣體積和樣品的濃度將明顯地影響蛋白質(zhì)的 分離度。,樣品的濃度范圍一般在0.01%-0.5%.,最好是高濃度、小體積、在一般范圍內(nèi)可以得 到好的分離效果。蛋白質(zhì)的樣品體積為柱體積 的1%-3%比較合適。,6、蛋白質(zhì)在變性條件下的分離, 變性溶劑如6mol/L鹽酸胍、8mol/L脲、0.1% 十二烷基硫酸鈉(SDS)等有助于精確地確定蛋白 質(zhì)的分子量。, 在變性溶劑中，柱的分離范圍因此而移到 低分子量范圍內(nèi)。,示例：用高效凝膠過(guò)濾色譜法(HPGFC)測(cè)定重組 人腫瘤壞死因子(rh-TNF)衍生物的相對(duì)分子量,rh-TNF屬基因工程藥物，其相對(duì)分子量的測(cè)定 是該藥質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一。,儀器與色譜條件：島津LC-10A HPLC 色譜柱：Beckman Ultraspherogel SEC 3000 (30cm7.5cm) 流動(dòng)相 0.1mmol/L KH2PO4 :0.1mmol/L Na2SO4(1 : 1) + 0.05% NaN3,流速: 1mL/min 檢測(cè)波長(zhǎng):280nm,標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對(duì)分子量曲線(xiàn)的制備： 選用四種蛋白：醛縮酶、血清白蛋白、碳酸酐 酶及抑蛋白酶肽制成的混合標(biāo)樣。考慮流速等 因素對(duì)保留時(shí)間T的影響而選用了內(nèi)標(biāo)法、既 在混合標(biāo)樣中加入右旋糖酐藍(lán)和酪氨酸作為內(nèi) 標(biāo)，進(jìn)樣后可同時(shí)測(cè)的完全排阻和完全進(jìn)入填 料孔的兩種內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間T0和Tt，用分配系 數(shù)Kd對(duì)相對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，從而保證結(jié)果有 良好的重現(xiàn)性。,樣品測(cè)定: 根據(jù)樣品的保留時(shí)間T求出其分配系數(shù)Kd，由Kd 從標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量曲線(xiàn)上查出相應(yīng)的lgMr， 計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量。,第九節(jié) 親合色譜法,親合色譜法是利用或模擬生物分子之間的專(zhuān) 一性作用，從復(fù)雜生物樣品中分離和分析特 殊物質(zhì)的一種色譜方法。,親合色譜的概念可以理解為配位體以共價(jià)鍵 形式與不溶性載體連接作為色譜介質(zhì)，高選擇 性地吸附分離具有生物活性的物質(zhì)，它將傳統(tǒng) 親合色譜的專(zhuān)一性與HPLC的快速，穩(wěn)定，檢測(cè) 方便等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)。,一、親合色譜分離機(jī)理,親合色譜是基于樣品中各種物質(zhì)與固定在載體 的配基之間的親合作用的差別而實(shí)現(xiàn)分離的。,親合色譜的過(guò)程是待分離物質(zhì)與配基間的親合 復(fù)合物形成及其解離的過(guò)程。,載體,L,X,配基,待分離物質(zhì),通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相將結(jié)合在配基固定相的 組分洗脫下來(lái)：,a) 如果親合復(fù)合物的親合力不強(qiáng),b) 當(dāng)配基與被分離組分的親合力較強(qiáng),c) 非常緊密地結(jié)合在固定相配基上的物質(zhì)洗脫,配基與待分離物質(zhì)的親合作用的強(qiáng)弱可以用親合 復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)來(lái)表示。這一常數(shù)不宜太低， 也不宜太高。太低專(zhuān)一性太差，太高則洗脫困難。,R：結(jié)合在親合色譜固定相上的生物分子的活力,K：復(fù)合物的離解常數(shù),L：固定化配基的濃度,二、親合色譜的固定相,親合色譜作為液相色譜的一個(gè)重要分支，對(duì)于生 物大分子的分離具有特殊的意義。原則上講，如 果在固相載體上連接一種具有生物特異性的配基， 就可以建立一種親合色譜方法，用于分離與配基 相對(duì)應(yīng)的物質(zhì)。,1、有機(jī)高分子類(lèi)：多孔的硬質(zhì)凝膠交聯(lián)聚 苯乙烯，交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯，親水性高聚性 等樹(shù)脂。,優(yōu)點(diǎn),具有均勻的粒度、較大的孔徑、良好的剛性， 廣泛的PH值的適應(yīng)性,對(duì)于生物大分子樣品都有較好的相溶性。,填料容易合成,2、無(wú)機(jī)基質(zhì),多孔硅膠,可控孔徑玻璃,3、高效親合色譜兼具親合色譜和高效液相色譜 的特點(diǎn),可以提高效率，還可以改善回收產(chǎn)物純度和 濃度,檢測(cè)靈敏度得以大幅度提高,具有更高的選擇性,配基結(jié)合的牢固性也可以延長(zhǎng)填料的壽命并 提高產(chǎn)物的質(zhì)量，這對(duì)生物工程的分離、純化 工作是非常有利。,三、親合色譜影響因素,1、平衡和平衡緩沖溶液,選擇平衡緩沖溶液所具有的PH值，離子強(qiáng)度， 溫度和化學(xué)組成都應(yīng)使配體與蛋白質(zhì)之間能發(fā) 生比較強(qiáng)的相互作用。,2、蛋白質(zhì)的濃度和溫度效應(yīng),對(duì)親合力一般或較高的蛋白質(zhì)，其互補(bǔ)酶的濃 度對(duì)親合容量的影響不明顯，柱頂端結(jié)合的大分 子與最初加入的大分子濃度無(wú)關(guān)。,溫度效應(yīng)在親合色譜中非常重要，因?yàn)橛H合 填料吸附作用的強(qiáng)度隨溫度升高而降低。,3、特異性洗脫,通常選用對(duì)純化的活性分子有高的親合力，但 其結(jié)構(gòu)與填料上的配體不同的配體來(lái)洗脫，這 樣就保證了