《CR與DNA測序》PPT課件.ppt

知識體系,PCR技術(shù),簡史,原理,反應(yīng)體系,技術(shù)特點,結(jié)果檢測,測序技術(shù) 原理,衍生技術(shù),A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母鏈DNA,復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉,子代DNA,參與DNA復(fù)制的物質(zhì),底物(substrate): dNTP 加入 聚合酶(polymerase): DNA聚合酶 分離 模板(template) : DNA母鏈 提取 引物(primer): 人工合成 其他的酶和蛋白質(zhì)因子 Mg2+, PCR儀,Part I 聚合酶鏈反應(yīng) （Polymerase chain reaction, PCR）,一、PCR技術(shù)簡史 PCR的實現(xiàn) 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件：摸板DNA 、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合適的緩沖體系，以及DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間。,第一節(jié) 常規(guī)PCR技術(shù),提高效率的思路,雙鏈,單鏈,循環(huán),DNA聚合酶,儀器改進,高溫,低溫,PCR的改進與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是： Klenow酶不耐高溫， 90會變性失活，每次循環(huán)都需 要重新添加。 引物鏈延伸反應(yīng)在37下進行，容易發(fā)生模板和引物 之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的 DNA片段不均一。,這種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導(dǎo)致聚合酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。,1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等從一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點：,耐高溫，在70下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%， 在93下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95下反應(yīng) 2h后其殘留活性是原來的40%。 在熱變性時不會被鈍化,不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。 大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度 (2.0Kb)。,由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。,二、PCR技術(shù)的基本原理,類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：,1、基本原理,退火（annealing）（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，將溫度降至引物的Tm值左右或以下（55左右），引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合，形成雜交鏈。,變性（denature）：模板DNA經(jīng)加熱至95左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備。,延伸(extension)：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。,以上三步為一個循環(huán)，約需24分鐘，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板，如此循環(huán)30次，大約23小時后，新生DNA片段理論上可達到2n-1個分子拷貝。,PCR反應(yīng)的基本原理示意圖,3 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTT 5 5 ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3,變性（950C，30s）,3TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTT5,5 ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 3,退火（450C550C，30s 1min）,5ataagcccgaaaggt3,3 aacggctaggcattt5,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT,ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,5 ataagcccgaaaggttcg,tccaacggctaggcattt 5,延伸（720C，1 幾分鐘）,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT,ataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt,循環(huán) 25 30,5,3,5,3,目的DNA擴增106-7倍,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,目的片段？,1、標準的PCR反應(yīng)體系 （50100ul）,三、PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件,10緩沖液 1/10體積 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各1u mol/L 模板DNA 1 02 1 05 拷貝 Taq DNA聚合酶 1 5u Mg2+ 1.5mmol/L 雙蒸水 至50100ul,2、PCR引物設(shè)計,PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5端引物和3引物。設(shè)計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5端引物與位于待擴增片段5端上游的一小段DNA序列相同；3端引物與位于待擴增片段3端的一小段DNA序列互補。,TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT,ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,5 ataagcccgaaaggttcg,tccaacggctaggcattt 5,5,3,5,3,基準,引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列。 兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其是避免3 端的互補重疊。,引物設(shè)計的基本原則：,引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。 引物的5 端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。,幾種常見引物設(shè)計缺陷,引物設(shè)計軟件,Primer Premier5.0 （自動搜索）* Oligo6 （引物評價） Vector NTI Suit DNAsis Omiga DNAstar Primer3 （在線服務(wù)）,3、模板的制備,PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫(yī)學(xué)標本有血斑、精斑、毛發(fā)等。,標本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。,4、PCR反應(yīng)條件的控制,PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子 鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L 底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20200umol/L TaqDNA聚合酶 2.5U（100ul） 引物 濃度一般為0.1 0.5umol/L,反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù) 變性溫度和時間 95，30s 退火溫度和時間 低于引物Tm值5 左右，一般在4555 延伸溫度和時間 72，1min/kb（10kb內(nèi)） Tm值=4(G+C) 2(A+T),循環(huán)次數(shù) 一般為25 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。,四、PCR反應(yīng)特點,PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： 引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；（關(guān)鍵） 堿基配對原則； Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性； 靶基因的特異性與保守性。,1、特異性強,2、靈敏度高,PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)級增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在細菌學(xué)中最小檢出率為3個細菌。,3、簡便、快速,不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。,4、對標本的純度要求低,五、PCR擴增產(chǎn)物的分析,1、凝膠電泳分析 瓊脂糖凝膠電泳: 通常應(yīng)用12%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。 聚丙烯酰胺凝膠電泳：610%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。,紫外線/燈下觀察結(jié)果,594bp,600bp,2652bp,800bp,50bp,350bp,M 1 2 3,HCMV PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果,PCR擴增結(jié)果,9 8 7 6 5 4 3 2 1,467bp,205bp,2、酶切分析 3、分子雜交 4、核酸序列分析,酶切結(jié)果,酶切結(jié)果,第二節(jié) 常用的PCR衍生技術(shù),（1）逆轉(zhuǎn)錄 所謂逆轉(zhuǎn)錄，是指以RNA為模板，利用宿主細胞中4種dNTP為原料在引物的3端以5 3方向合成與RNA互補的DNA鏈的過程，此過程與中心法則相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）。在逆轉(zhuǎn)錄過程中以RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶稱為逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptnase）。實際上，逆轉(zhuǎn)錄并非轉(zhuǎn)錄，而是一種復(fù)制形式，必須有引物存在才能完成。,1. 逆轉(zhuǎn)錄PCR （ reverse transcription PCR, RT-PCR）,（2）逆轉(zhuǎn)錄酶,1970年Temin在Rous肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，以后發(fā)現(xiàn)所有RNA腫瘤病毒中都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA編碼的，是多功能酶： 具有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，能和其它DNA聚合酶一樣，沿5 3方向合成DNA，并需要引物提供3-OH ；,具有RNA酶H（RNaseH）活性，能特異性水解RNA-DNA雜交體上的RNA； 具有DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，以逆轉(zhuǎn)錄合成的單鏈DNA為模板合成互補DNA鏈。 逆轉(zhuǎn)錄酶對DNA沒有3 5外切酶活性，因此它沒有校對功能，錯誤率相對較高。,細胞總RNA的檢測,1. Total RNA extracted from 293 transfected with pAd-CMV-E6/E7 2. Total RNA extracted from 293 transfected with pAd-K14-E6/E7,3. RT-PCR的反應(yīng)體系,逆轉(zhuǎn)錄體系,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在420C進行1h 后，加熱至950C5min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。取2 l反應(yīng)產(chǎn)物，按DNA為模板的PCR反應(yīng)步驟，進行擴增反應(yīng)。, HPV-16 E6/E7在轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR檢測結(jié)果,1. Marker ：100bp DNA Marker ; 2. RT-PCR 產(chǎn)物：E6/E7基因; 3. 陰性對照 RT-PCR鑒定pAd-CMV-E6/E7 轉(zhuǎn)染的293細胞中E6/E7的表達,2 . 巢式PCR 先用一對外側(cè)引物擴增含目的基因的大片段，再用內(nèi)側(cè)引物以大片段為模板擴增獲取目的基因。筑巢PCR可以提高PCR的效率和特異性。適于模板含量較低的樣本。,目的片段,第一輪PCR,第二輪PCR,3. 多重PCR 在一次反應(yīng)中加入多對引物，由于每一對引物與模板DNA的不同片段相結(jié)合，因而擴增片段長短不同。由此可檢測是否存在某些基因片段的缺失或突變。,片段1,片段2,DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應(yīng)。在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學(xué)性修飾堿基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點。它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域，在哺乳動物中mC約占C總量的27。,4. 甲基化特異性PCR,基本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后用3對特異性的引物對所測基因的同一核苷酸序列進行擴增。擴增產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結(jié)果。,針對擴增的DNA甲基化區(qū)域，一般需要設(shè)計三條引物：正常序列引物、甲基化對應(yīng)引物以及DNA序列修飾引物。通過三組PCR，判斷DNA序列中甲基化的存在與否。,5. 原位PCR,在組織細胞里進行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點。在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列。, 固定組織或細胞,蛋白酶K消化處理,PCR擴增：原位PCR儀,雜交,顯微鏡觀察結(jié)果,6. 定量PCR,廣義概念的定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標準，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進行PCR起始模板量的定量。 狹義概念的定量PCR技術(shù)（嚴格意義的定量PCR技術(shù)）是指用外標法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測PCR過程（監(jiān)測擴增效率）達到精確定量起始模板數(shù)的目的，同時以內(nèi)對照有效排除假陰性結(jié)果(擴增效率為零)。,實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。, 熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種： 熒光探針和熒光染料,TaqMan熒光探針： PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收。,在PCR反應(yīng)的退火過程中，熒光探針便會和模板雜交。進一步在PCR反應(yīng)的延伸過程中， Taq酶的53外切酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針，游離熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。 從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。,SYBR熒光染料： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。,擴增曲線：4個階段, Ct值（循環(huán)閾值，Cycle threshold）：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),熒光域值（threshold）：PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：熒光信號開始由本底信號進入指數(shù)增長階段的拐點時的熒光信號強度。,熒光閾值,循環(huán)次數(shù), Ct值與起始模板的關(guān)系,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。,其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。,Part II DNA測序技術(shù),DNA的測序是分子生物學(xué)研究中非常重要和關(guān)鍵的內(nèi)容。對DNA一級結(jié)構(gòu)的研究，有助于探索基因結(jié)構(gòu)與功能、基因與疾病關(guān)系，進而推動生命科學(xué)研究獲得質(zhì)的飛躍。測定基因組的全部核苷酸序列、閱讀和分析全部遺傳信息，正是人類基因組計劃（human genome project, HGP)的最主要目標之一。,將DNA片段用熒光等分析儀，測出DNA序列堿基排列順序。 DNA 序列測定方法： 1. Sanger的雙脫氧法：A/T/G/C四個反應(yīng)。 2.化學(xué)降解法：G反應(yīng)；G+T反應(yīng)；T+C反應(yīng)和C反應(yīng)。 3.自動測序法。,DNA 測序的主要方法有兩種，即雙脫氧鏈終止法（Sanger 法、酶促法）和化學(xué)裂解法（Maxam-Gelbert 法）。二者均依賴于高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。不管是酶促法還是化學(xué)法，都是分為4個反應(yīng)體系進行測序反應(yīng)，寡核苷酸鏈分別終止于不同位置的A、T、G或C堿基。4種反應(yīng)體系的寡核苷酸鏈產(chǎn)物，進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影后，讀出待測DNA的連續(xù)序列。,一、 Sanger 雙脫氧鏈終止法,（一）原理(單鏈) DNA鏈中的核苷酸是以3，5-磷酸二酯鍵相連接，合成DNA所用的底物是2-脫氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger 雙脫氧鏈終止法中被摻入了2，3-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),當ddNTP位于鏈延伸末端時, 由于它沒有3- OH，,不能再與其它的脫氧核苷酸形成3,5-磷酸二酯鍵，DNA合成便在此處終止，如果此處摻入的是一個ddATP，則新生鏈的末端就是A，依次類推可以通過摻入ddTTP、 ddCTP、 ddGTP ，則新生鏈的末端為T、C或G，根據(jù)這個原理，Sanger與1977年建立了雙脫氧鏈終止測序法。他本人也因此而獲得了諾貝爾獎。,Sanger,雙脫氧核苷三磷酸,互補鏈合成過程,以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新生DNA的合成，因此又稱為引物合成法，或酶促引物合成法。主要是基于DNA聚合酶的催化特性：以DNA為模板，根據(jù)堿基配對的原則逐個將dNTP加到與模板結(jié)合的寡核苷酸引物的3-OH末端，形成正確的模板DNA互補鏈；能以dNTP作為底物，也能利用ddNTP作底物，將其摻入寡核苷酸鏈的3 末端而終止新生互補鏈的延伸。,如果在DNA的合成反應(yīng)中，除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，再加入一種少量的2,3 ddNTP，那么多核苷酸鏈的延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開競爭，所以反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的長短不一的核苷酸鏈。 在4組獨立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果將生成4組核苷酸鏈，它們將分別（隨機）終止于每一個A，每一個G，每一個C，每一個T的位置上。對這4組核苷酸鏈進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。,在測序反應(yīng)中通常設(shè)置4個反應(yīng)，各反應(yīng)管中同時加入一種DNA模板和引物、DNA聚合酶I（失去5 3外切核酸酶活性）、其中一管中分別加入1種 ddNTP （ 如ddTTP、dTTP）以及4種dNTP（ dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP ），引物末端用放射性核素標記， ddTTP的比例很?。?:10），因此摻入的位點是隨機的，經(jīng)過適當?shù)臈l件下溫育，將會有不同長度的DNA片段合成。它們都具有相同的5末端，3末端都因摻入了ddTTP而以T結(jié)尾。在其它三管中同理加入相應(yīng)的ddNTP。,Sanger雙脫氧測序方法示意圖,+G,+ddG,GATTCG,GATTC ddG,GATTCGAG,GATTCGA ddG,GG G,引物,電泳,雙脫氧法測序原理示意圖,幾乎與雙脫氧鏈終止法建立的同時，Maxam和Gilbert于1977年建立了一種以化學(xué)修飾為基礎(chǔ)的DNA序列分析法，稱為Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法。,二、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法,（一） Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法原理,基本原理：用化學(xué)試劑處理具末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產(chǎn)生一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應(yīng)混和物，經(jīng)凝膠電泳按大小分離和放射自顯影，便可根據(jù)X線片底板上顯示相應(yīng)帶譜，直接讀出待測DNA片段的核苷酸順序。,化學(xué)修飾法的待測DNA片段有的是雙鏈，有的是單鏈DNA。在進行堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)前，首先對待測DNA片段作末端標記，使其末端(5端或者是3端)帶上放射標記。如果待測DNA是雙鏈，必須使其形成末端標記的單鏈。,對末端標記的DNA鏈進行化學(xué)斷裂反應(yīng)分兩步進行： 第一步是在4個反應(yīng)管中分別以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸對特定的堿基進行化學(xué)修飾； 第二步是以六氫吡啶取代被修飾的堿基并將DNA鏈斷裂。,DNA化學(xué)裂解反應(yīng)體系 反應(yīng)體系 堿基修飾試劑 堿基修飾反應(yīng) 主鏈斷裂試劑 斷裂點 G 硫酸二甲酯 鳥嘌呤甲基化 六氫吡啶 G G+A 甲酸 脫嘌呤作用 六氫吡啶 G和A C+T 肼 嘧啶開環(huán) 六氫吡啶 C和T C 肼