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,液相色譜法分離手性藥物,概念,許多藥物中存在著分子組成與構(gòu)造完全相同但分子的立體結(jié)構(gòu)不同的化合物,他們是立體異構(gòu)體,不能完全疊合但能互為鏡像,(如左手與右手),這就是手性(chirality)。,手性藥物,藥物作用的靶分子都是手性的,因此藥物分子與靶分子的不對稱性必須相匹配(手性識別手與手套)。 另外,分子藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),含有手性因素的化學(xué)藥物對映體,在人體內(nèi)的藥理活性、代謝過程和毒性存在著顯著差異。在通常情況下,只有一個對映體具有藥理作用,而另一個對映體不僅無藥理作用,還會產(chǎn)生一定副作用。 如20世紀(jì)60年代,鎮(zhèn)靜藥反應(yīng)停(thalidomide,沙利度胺)的消旋體用作緩解妊辰反應(yīng)作用,后來發(fā)現(xiàn)在歐洲服用過的孕婦不少產(chǎn)下海豚狀畸形兒。隨后研究表明:反應(yīng)停右旋體(R型)有鎮(zhèn)靜作用,左旋體(S型)具有胚胎毒性和致畸作用。,研究背景,1992年FDA發(fā)布手性藥物指導(dǎo)原則,要求所有在美國上市的消旋體新藥,生產(chǎn)者均需提供詳細(xì)報告,說明藥物中所含對映體各自的藥理作用、毒性和效果。 顯然,單一異構(gòu)體的試驗次數(shù)比較單純,經(jīng)濟上更合算。 目前普遍使用的2000多種合成藥物中有600余種為手性藥物,而活性的單一對映體藥物不足100種,其它500余種都是左右旋混在一起的消旋體藥物。 1999年,手性藥物市場第一次超過1000億美元,單一異構(gòu)體藥物銷售額達(dá)到1150億美元,占世界藥品市場3600億美元的32%。,常用的手性藥物測定技術(shù),高效液相色譜 (HPLC) 氣相色譜 (GC)(樣品需具有一定的揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性) 毛細(xì)管電泳(HPCE) 超臨界流體色譜(SFC),HPLC,80年代初HPLC法迅速成為藥物對映體分離和測定最為廣泛應(yīng)用的方法。 特別適用于極性強、熱穩(wěn)定性差的手性藥物的分析。 HPLC用于手性分離概括起來可分為兩大途徑:間接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。,液相色譜法分離手性藥物,直接法(CMPA、CSP): 對映體之一與手性固定相或手性流動相添加劑間發(fā)生分子間的三點作用(較穩(wěn)定),另一對映體發(fā)生兩點作用;形成暫時的非對映異構(gòu)體的結(jié)合物質(zhì),通過洗脫分離。 間接法(CDR) 又稱為非對映體拆分法或柱前手性衍生化法 對映體混合物在預(yù)處理中進(jìn)行柱前衍生組成一對非對映體(Diastereoisomers) ,依其理化性質(zhì)的差異,在非手性柱上得以分離。,間接法:柱前衍生,優(yōu)點: *可采用通用的非手性柱分離; *通過衍生化可提高檢測靈敏度; *分離條件簡單; *分離效果好 缺點: *要有可被衍生化的基團; *要有高光學(xué)純度的手性試劑; *對個對映體衍生化率速和平衡常數(shù)應(yīng)一致; *衍生化和色譜過程中不能發(fā)生消旋化;,直接法:,手性流動相添加劑(CMPA)法: (又可稱為手性流動相(CMP)拆分法或手性洗脫法) & 環(huán)糊精(Cyclodextrins)類(主要是-、-和-環(huán)糊精及其衍生物); & 手性離子對配合劑(Chiral Ion Pair Complex,CIPC),如(+)-10-樟腦磺酸、奎寧和奎尼丁等; & 配位體交換型手性流動相添加劑(Chiral Ligand-exchange Complexs, CLEC) 。 手性固定相(CSP)法,手性固定相(CSP)法,優(yōu)點是: 能廣泛適用于各類化合物,適于常規(guī)及生物樣品的分析測定; 除非必須衍生化,否則無需高光學(xué)純度試劑; 樣品處理步驟簡單。 制備分離方便,定量分析的可靠性較高; 缺點是: 樣品有時也須作柱前衍生(但不一定是手性衍生化試劑), 對樣品結(jié)構(gòu)有一定限制,其適用性尚不及普通HPLC固定相(包括正相和反相)那樣廣泛。 迄今為止,CSP柱商品已有40多種,價格大多昂貴,尚未有一種具有類似ODS柱的普遍適用性。,常用的手性固定相(CSP)法,& 刷(Brush)型或稱為Prikle型 & 手性聚合物固定相(如纖維素、淀粉,合成的手性聚合物); & 含肽或蛋白質(zhì)手性固定相; & 含環(huán)糊精(Cyclodextrin)及其衍生物的手性固定相; & 大環(huán)抗生素(Macrocyclic antibiotics)型 & 配位交換(|Ligand exchange)型 & 冠醚(Crown ethers)型,在手性拆分中,溫度的影響是很顯著的。低溫增加手性識別能力,但可能引起色譜峰變寬而導(dǎo)致分離變差。因此確定手性分析方法過程中要考慮柱溫的影響,確定最優(yōu)柱溫。 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇合適的CSP柱是非常重要的。 Chiral Technologies Europe(法國)和Chiral Technologies(美國,是日本Daicel化學(xué)工業(yè)公司的全資子公司 )是專門為制藥和農(nóng)業(yè)化學(xué)及相關(guān)工業(yè)提供對映體分離服務(wù)的公司。服務(wù)的領(lǐng)域包括分析方法的開發(fā)和cGMP噸級單一對映體的分離和商業(yè)規(guī)模工藝的開發(fā)等。 手性聚合物固定相商品柱主要是日本Daicel公司制造的Chiralcel柱。 Daicel固定相的廣泛選擇性和高負(fù)載性能,使Chiral Technologies及整個Daicel集團成為手性色譜產(chǎn)品和服務(wù)市場的領(lǐng)先者。Daicel的手性固定相是以纖維素為基礎(chǔ)的,如將甲酰(3,5-二甲苯胺)基引入纖維素的羥基。,合適的CSP柱,手性聚合物固定相Chiralcel柱類型與應(yīng)用,經(jīng)驗,CHIRALPAK AD-H CHIRALCEL OD-H(50-60%) CHIRALCEL OJ-H # CHIRALPAK AS-H (20%),DAICEL 柱使用的溶劑,流動相采用烷烴-醇混合物體系(主要是正己烷-異丙醇),極性溶劑乙醇、甲醇、乙腈容許存在。 以下溶劑一點也不可以存在(會破壞柱子): 丙酮、氯仿、DMF、DMSO、THF、甲苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、吡啶,流動相添加劑,酸性化合物:TFA乙酸、甲酸 堿性化合物:DEA乙醇胺、丁醇胺 加入量0.1-0.2,不超過0.5。 柱子穩(wěn)定的PH范圍:2.0-7.0。,樣品溶解性,樣品含量0.5mg/ml1.0mg/ml. 酸性化合物和堿性鹽,可加添加劑來增加樣品的溶解性。 仍不好溶,可溶于100醇(甲醇、乙醇、異丙醇);若流動相中有烷烴則不可用乙腈. 水溶性化合物最好用反相柱,如OD-R、OD-RH、OJ-RH、AD-RH、AS-RH; 可用醇-水、乙腈-水作流動相。,柱子壓力過高,原因:可能是雜質(zhì)堵住了柱頭(frit)。 可更換在線過濾器(in-line filter)或保護柱,或注射前過濾樣品。 由于
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