實驗三細菌的簡單染色和革蘭氏染色.ppt

實驗三,細菌的簡單染色和革蘭氏染色,一、實驗目的及要求,學習微生物涂片、染色的基本技術， 掌握細菌的簡單染色法。 學習并掌握革蘭氏染色法，了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。 鞏固油鏡的使用和無菌操作技術。,二、實驗原理,簡單染色法是利用單一染料使細菌著色以顯示其形態(tài)的染色方法。常用于染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。 堿性染料電離時，其分子染色部分帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。由于細菌生長于中性環(huán)境中一般帶負電荷，所以通常采用堿性染料使其著色。 當細菌分解糖類產酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。,革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram創(chuàng)立的。作為細菌學上最常用最重要的鑒別染色法，革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G）兩大類。 G菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經番紅復染后就成紅色。 G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。,三、實驗器材,1.菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）， 大腸桿菌（Escherichia coli）， 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 2. 染色劑：草酸銨結晶紫染液或齊氏石炭酸復紅染 液，革蘭氏染色液。 3. 其他：顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，雙層瓶 （內裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，廢液缸等。,四、實驗步驟,1、簡單染色： （1）涂片：注意取菌不要太多； （2）干燥：室溫自然干燥； （3）固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上， 通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）； （4）染色：涂片加草酸銨結晶紫染液或齊氏石炭酸復 紅染液 1min； （5）水洗：自來水沖洗，直至流下的無色； （6）干燥：自然晾干或用電吹風吹干； （7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當?shù)?視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏 油，油鏡觀察細菌的形態(tài)。,2、革蘭氏染色 （1）制片：制片方法與簡單染色相同； （2）初染：加適量（以剛好覆蓋菌膜為 宜）的結晶紫染色液染色1-2min，水洗； （3）媒染：碘液媒染1min，水洗； （4）脫色：連續(xù)滴加95%乙醇脫色20-30s至流出液無色， 立即水洗； （5）復染：滴加番紅復染約2min，水洗； （6）鏡檢：干燥后，油鏡鏡檢觀察。 （7）混合涂片法：按上述方法，在同一載玻片上，以大腸 桿菌和枯草芽孢桿菌或大腸桿菌和金黃色葡 萄球菌作混合涂片、染色、鏡檢進行比較。,Gram Stain,G+,干燥、固定,結晶紫染色,G-,碘液媒染,乙醇脫色,蕃紅復染,Figure Mixed culture of large Gram positive rod and small Gram negative rods.,五、注意事項,革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規(guī)定。 染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。 選用幼齡的細菌。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。,六、