乙肝病毒A1762、G1764雙突變是篩選男性HBsAg攜帶者肝癌最高危人群的生物學(xué)標(biāo)記.doc

乙肝病毒a1762、g1764雙突變是篩選男性hbsag攜帶者肝癌最高危人群的生物學(xué)標(biāo)記廣西醫(yī)學(xué)2011年2月第33卷第2期論著乙肝病毒a1762,g1764雙突變是篩選男性hbsag攜帶者肝癌最高危人群的生物學(xué)標(biāo)記l29王學(xué)燕李國堅(jiān)董柏青楊進(jìn)業(yè)陳欽艷方孔雄黃堅(jiān)韋少超方鐘燎carolineasabintimjharrison(1廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心,南寧市530028;2廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳,南寧市530021;3廣西隆安縣疾病預(yù)防控制中心532700;4英國倫敦大學(xué)學(xué)院,londonwit4jf)【摘要】目的探討乙肝病毒a1762,g1764雙突變是否可作為篩選hbsag攜帶者肝癌最高危人群的生物學(xué)標(biāo)記.方法對(duì)2258名乙肝病毒無癥狀攜帶者進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究,其中hbva1762,g1764雙突變株組1261人,野毒株組997人,跟蹤隨訪隊(duì)列,每6個(gè)月1次對(duì)觀察對(duì)象抽血進(jìn)行甲胎蛋白(afp)檢測(cè)及b超體檢以檢查肝癌發(fā)病情況.結(jié)果觀察48個(gè)月,2258名乙肝病毒無癥狀攜帶者中,共發(fā)生肝癌72例,突變株組64例,野毒株組8例,發(fā)病率分別為932.2/10萬人年和203.5/10萬人年,兩組發(fā)病率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001),相對(duì)危險(xiǎn)度(rr)為4.58.突變株組男性發(fā)病率1827.8/10萬人年,明顯高于野毒株組的180.5/10萬人年,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0.001),相對(duì)危險(xiǎn)度為%的男性病例有雙突變;突變株組女性發(fā)病率為686.6/10萬人年,高于野毒株組的233.3/10萬人年,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),但相對(duì)危險(xiǎn)度僅為2.94.結(jié)論雙突變是篩選男性hbsag攜帶者中肝癌最高危人群的很好生物學(xué)標(biāo)記,但對(duì)女性篩選肝癌高危人群的意義不如男性.【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒;表面抗原無癥狀攜帶者;a1762,g1764雙突變;生物學(xué)標(biāo)記【中圖分類號(hào)】r373.21【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a【文章編號(hào)】02534304(2011)0243129434hbvcorepromoterdoublemutatioils(a1762,g1764)constituteavaluablebiomarkertoidentityasubsetofhbsagmalecarriersatextremelyhighriskofhepatocellularcarcinomawangxueyah,liguo-jian,d0j7,7gbaiqing,yangjinye,chenqinyah,fangkongxiong,huangjian3.welshaochao,fangzhongliao1,carolineasabin4.timjharrison4(1guangxizhuangautonomousregioncentrefordeasepreventionandcontrol,nanning530028,china;2thepublichealthbureauofguangxizhuangautonomousregion,nanning530021,china;3longancentrefordiseasepreventionandcontrol,longancounty532700,china;4universitycollegelondon,londonw1t4jr,tunitedkingdom)【abstract】objectivetodeterminewhetherhbvcorepromoterdoublemutations(a1762,g1764)constituteavaluablebiomarkertoidentityasubsetofhbsagcarriersatextremelyhighriskofhepatocellularcarcinoma(hcc.methodsacohortof2258hbsagpositivesubjectswasrecruited.whichconsistofhbva1762,g1764mutantgroupn=1261)andwildtypegroup(n=997).ti1estudysubjectsweremlowedup6一monthlywithapurposetodiagnosehccbymeasurementsofseirlmalphafetoproteinlevelsanduhrasonographicexaminations.resultsseventytwocasesofhccwerediagnosedafter48monthsoffollow.up.therewere64easesinthemutantgroupand8casesi11thewildtypegroup,givinghccratesof932.2/100000versus203.5/100000personyears,respectively,thedifferencewassignificant(p<0.001).rherelativerisk(rr)was4.58.withfurtherstratificationaccordingtogender.theincidenceratesofmalemutantgroupandmalewild.typegroupwerel827.8/l00000andi80.5/l0o000personyears.respectively.thedifferencewasalsosignificant(p<0.0o1)andrrwas10.13.specially.92.5%(49/53)ofthemalecasesinthecohortwereinfectedwiththemutanttype.theincidenceratesoffemalemutantgroupandfemalewildtypegroupwere686.6/100000and233.3/100000personyearsrespectively,thedifferencewassignificant(p<0.05),rrwasonly2.94.conclusionthedatasuggestedthatthedoublemutations(a1762,gl764)maybeagoodbiomarkertoidentifyasubsetofmalehbsagcarriersatextremelyhighriskofhccbutthevalueislessinfemale.【keywords】hepatitisbvirus;hbsagasymptomaticcarriers;a1762,g1764doublemutations;biomarker基金項(xiàng)目:英國wellcome基金會(huì)資助項(xiàng)目(072058/z/03/z)通信作者:方鐘燎.email:zhongliaofanghotmail.con130原發(fā)性肝癌是世界第五大惡性腫瘤,80%以上的病例發(fā)生在非洲的撒哈拉和東亞,其中我國病例數(shù)占全世界病例數(shù)的50%以上,我國東南沿海包括廣西肝癌發(fā)病率最高.肝癌是廣西第一大惡性腫瘤,廣西肝癌粗死亡率為27.31/10萬,占全區(qū)各種惡性腫瘤的34.12%.目前肝癌的主要治療手段仍然是手術(shù)治療,肝癌存活率取決于早期診斷,我國小肝癌患者5年存活率高達(dá)61.3%53.然而,由于肝癌的早期癥狀比較隱蔽,大多數(shù)病例發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)入晚期,失去手術(shù)治療機(jī)會(huì).定期檢測(cè)血清afp和肝臟b超檢查可發(fā)現(xiàn)適合手術(shù)治療的早期肝癌.然而,居于全人群的肝癌監(jiān)測(cè)將耗費(fèi)巨大的公共衛(wèi)生資源,在大多數(shù)發(fā)展中國家是行不通的.我們發(fā)現(xiàn)96%的廣西肝癌患者乙肝病毒(hbv)核心基因啟動(dòng)子有雙突變,而hbsag無癥狀攜帶者中僅有24%有同樣突變j.因此,假如這個(gè)雙突變能夠作為篩選肝癌高危人群的標(biāo)記將為我們進(jìn)行肝癌監(jiān)測(cè)將能夠節(jié)省大量的衛(wèi)生資源.為驗(yàn)證這個(gè)假設(shè),2004年我們?cè)诼“部h建立了一個(gè)由3000名乙肝病毒無癥狀攜帶者組成的前瞻性研究隊(duì)列,現(xiàn)將4年的觀察結(jié)果報(bào)告如下.1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象研究對(duì)象為廣西隆安縣3055歲的農(nóng)村居民,以分層抽樣方法抽取研究對(duì)象并進(jìn)行靜脈抽血,檢測(cè)hbsag,對(duì)hbsag陽性者做甲胎蛋白(afp)檢測(cè),剔除所有afp陽性者以排除現(xiàn)癥肝癌,同時(shí)檢測(cè)丙型肝炎抗體,剔除所有丙型肝炎抗體陽性者以排除丙型肝炎病毒混合感染對(duì)肝癌發(fā)病率的混淆影響,對(duì)其余hbsag陽性者做血清hbvdna檢測(cè).本研究經(jīng)過廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并由研究對(duì)象簽署知情同意書.1.2血清學(xué)檢測(cè)用elisa法檢測(cè)hbv血清學(xué)標(biāo)記及afp,用賴氏法檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt).初篩重復(fù)兩次檢測(cè)hbsag陽性判為hbsag陽性者.1.3hbvdna擴(kuò)增按照酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)常規(guī)法抽取hbvdna.用套式pcr擴(kuò)增dna,第1輪擴(kuò)增引物為to35(nt124012605-gcgctg-cagaaggtrtgqv,gctcctctg-3,)和mdc1(nt2304-23245:tigataagatacw_w,catitg-3);第2輪擴(kuò)增引物為cprf1(nt167816955:caa11c:tcaacgaccgacc-3和cram)(nt192819485=gagtaacclacagtagcic一3,每輪擴(kuò)增反應(yīng)條件相同:熱啟動(dòng)945min;94c30s,5530s,72oc30s,30個(gè)循環(huán)后,7210min,225min.反應(yīng).對(duì)匕述增dna陰性的標(biāo)本,用另一套引物進(jìn)行擴(kuò)增:第一輪擴(kuò)增引物為i2(26)guangximedicaljournal,feb.2011,vo1.33,no.2(nt18231806,5-ccggaaagctrgaggcatgg,c3v,g-3)和xseq1(nt1547_1569,5:ccccgtct-gciria眥3,;第二輪擴(kuò)增引物為cprf1和mdn5r(nt1794-1774,5:atitaiu,cctacagcc3ect-3,每輪擴(kuò)增反應(yīng)條件與上述相同.取第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物5l在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,電壓100v,用tae緩沖液.溴化乙啶染色后在紫外線分析儀下觀察.1.4dna序列分析用genelutepcrcleanupkit(sigma,st.louis,mo)按照試劑盒說明書純化陽性擴(kuò)增產(chǎn)物.取2純化dna用于序列測(cè)定,測(cè)序引物為cprr1或cprf1,試劑盒為bigdyeterminatorv3.1cyclesequencingkit(appliedbiosystems,fostercity,ca).1.5隨訪調(diào)查人員經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn),使用統(tǒng)一的詢問調(diào)查表,作抽樣重復(fù)調(diào)查.從2004年7月起,對(duì)隊(duì)列進(jìn)行跟蹤隨訪,每半年1次;對(duì)hbsag陽性的兩組觀察對(duì)象抽血進(jìn)行hbv血清學(xué),afp,alt檢測(cè)及b超體檢,觀察肝癌發(fā)病情況,詳細(xì)記錄每位觀察對(duì)象的健康狀況,至2008年6月止.所有肝癌病例均由縣級(jí)及以上醫(yī)院根據(jù)中國抗癌協(xié)會(huì)發(fā)布的肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行復(fù)診.1.6人年計(jì)算用近似法計(jì)算,觀察開始后,沒有新進(jìn)人隊(duì)列的人群,以2004年7月人戶隨訪為觀察起點(diǎn),肝癌者以醫(yī)院初次確診時(shí)間,死亡者以死亡時(shí)間,失訪者以失訪前最后1次隨訪年月為終點(diǎn)時(shí)間,其余人員以2008年6月為終點(diǎn)時(shí)間計(jì)算人年數(shù),即如果研究對(duì)象從2004年7月入組至2008年6月止,健康狀況良好,則隨訪時(shí)間為48個(gè)月,折合4.0人年.1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用spss17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)比較采用x檢驗(yàn)法,取雙側(cè)檢驗(yàn),以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1一般情況在隆安縣共抽取當(dāng)?shù)剞r(nóng)村居民273,10名進(jìn)行hbsag檢測(cè),陽性率為14.5%(3964/2734o).男性陽性率(16.7%)顯著高于女性的12.6%(x2=89.737,p<0.001).男,女hbsag陽性率均呈隨年齡增長(zhǎng)而下降趨勢(shì),見表1,其中有2354份標(biāo)本獲得乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子序列,剔除不符合要求如hbvdna陰性或核心基因啟動(dòng)子區(qū)域缺失突變等后,共有2258名觀察對(duì)象,分為兩組,乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子雙突變組1261名和野毒株組997名,年齡分別為:(39.5.4-6.8)歲和(37.67.1)歲;男性有702名在突變組,561名在野毒株組,年齡為(38.66.6)歲和(37.16.9)歲;女性有559名在突變,436名在野毒株組,年齡分別為(40.66.9)歲,(38.37.4)歲.tt學(xué)2011年2月第33卷第2期表1hbsag在不同性別,年齡分布情況131注:男,女hbsag陽性率:x=89.737,p<0.001.2.2不同性別年齡乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子雙突變率比較男,女乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子雙突變率相同,均為53.7%(704/1310和560/1044),突變率有隨年齡增長(zhǎng)而增加趨勢(shì),其中30歲年齡組和35歲年齡組突變率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x:12.171,p<0.001),見表2,表3表2hbv核心基因啟動(dòng)子雙突變性別分布表3hbv核心基因啟動(dòng)子雙突變年齡分布2.3肝癌發(fā)病率觀察48個(gè)月,發(fā)生肝癌72例,其中64例發(fā)生在突變組,8例發(fā)生在野毒株組,發(fā)病率分別為932.2/10萬人年和203.5/10萬人年,兩組發(fā)病率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()(=32.93,p<0.001),相對(duì)危險(xiǎn)度(rr)為4.58,提示雙突變與肝癌的發(fā)生有關(guān).按性別進(jìn)行分層分析,突變株組男性發(fā)生肝癌49例,野毒株組男性發(fā)生肝癌4例,兩組發(fā)病率分別為1827.8/10萬人年和180.5/10萬人年,突變株組發(fā)病率高于野毒株組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001),相對(duì)危險(xiǎn)度為l%(49/53)的男性病例有雙突變,提示核心基因啟動(dòng)子雙突變是篩選男性hbsag攜帶者中肝癌最高危人群的很好的生物學(xué)標(biāo)記.女性發(fā)生肝癌19例,15例發(fā)生在突變株組,4例發(fā)生在野毒株組,兩組發(fā)病率分別為686.6/10萬人年和233.3/10萬人年,兩組發(fā)病率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),相對(duì)危險(xiǎn)度為2.94,可見,雙突變作為女性篩選肝癌高危人群的價(jià)值不如男性的高.表4突變組和野毒株組肝癌發(fā)病率(隨訪48個(gè)月)3討論據(jù)我們所知,本研究是世界上第一個(gè)以前瞻性隊(duì)列研究來確定慢性乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子雙突變株感染者肝癌發(fā)病率是否顯著高于野毒株感染者,以及該雙突變是否可作為肝癌高危人群的標(biāo)記.本研究結(jié)果顯示雙突變是肝癌的病因性危險(xiǎn)因素,92.5%的男性肝癌病例發(fā)生在雙突變組,提示雙突變是篩選男性hbsag無癥狀攜帶者中肝癌高危人群的生物學(xué)標(biāo)記.然而,雖然女性突變株組肝癌發(fā)病率也顯著高于野毒株組(p<0.05),但是,其相對(duì)危險(xiǎn)度比較小,提示該生物學(xué)標(biāo)記在女性hbsag無癥狀攜帶者中的應(yīng)用價(jià)值相對(duì)較小.我們及chu等研究核心基因啟動(dòng)子雙突變與肝癌的發(fā)生有關(guān)以來,已有很多后續(xù)的研究證實(shí)我們的研究結(jié)果.kao等認(rèn)為雙突變可能是預(yù)測(cè)慢性乙肝病毒感染者的臨床結(jié)果標(biāo)記.回顧性巢式匹配病例對(duì)照研究結(jié)果顯示,該雙突變是肝癌的危132險(xiǎn)因素.然而,這些研究都是橫斷面或病例對(duì)照研究,不能證明雙突變與肝癌的因果關(guān)系,也不能計(jì)算發(fā)病率.kuang等回顧性隊(duì)列分析結(jié)果提示,雙突變發(fā)生在肝癌診斷前,證明雙突變可能是肝癌的病因,但其研究樣本量小(只有120名觀察對(duì)象),不可避免產(chǎn)生選擇性偏倚,也不能計(jì)算突變株組和野毒株組的肝癌發(fā)病率.本研究克服了上述這些問題.本研究發(fā)現(xiàn)隆安縣居民hbv核心基因啟動(dòng)子雙突變株感染率較高,達(dá)53.7%,似乎降低了本標(biāo)記物的使用價(jià)值,但是我們并不是這樣認(rèn)為,因?yàn)檫@個(gè)突變株的高感染率正好提示該突變株是隆安縣肝癌高發(fā)的原因,我們?cè)?jīng)報(bào)告廣西人群乙肝病毒核心基因啟動(dòng)子雙突變株感染率約為25%左右,廣東感染率為10%,湖南為30%.目前,廣西30歲以上男性hbsag陽性被認(rèn)為是肝癌高危人群并建議他們定期到醫(yī)院接受肝癌檢查增,考慮到廣西及其他肝癌高發(fā)地區(qū)乙肝病毒高感染率和有限的衛(wèi)生資源,用本標(biāo)記物篩查將可進(jìn)一步縮減肝癌高危人群數(shù),至少可縮減一半人數(shù),將節(jié)省大量的衛(wèi)生資源.本研究總共隨訪3000名hbsag陽性攜帶者,其中有700多名為hbvdna陰性,無法確定其核心基因啟動(dòng)子序列而被排除隊(duì)列分析,我們所用的引物檢測(cè)的敏感性為10一10拷貝病毒/iill,已有研究報(bào)告高病毒量(10/m1)與肝癌的發(fā)生有關(guān).本研究發(fā)現(xiàn)這700名患者肝癌發(fā)病率很低(未發(fā)表資料),因此,我們未來將進(jìn)一步研究本隊(duì)列病毒載量與肝癌的關(guān)系,查明病毒量是否可以用來進(jìn)一步縮減肝癌高危人群數(shù)的生物學(xué)標(biāo)記.123456參考文獻(xiàn)parkindm,brayf,ferlayj,eta1.estimatingtheworldcancerburden:globocan2000j.intjcancer,2001,94(2):153156.mcglynnka,londonwt.epidemiologyandnaturalhistoryofhepatocellularcarcinomaj.bestpractice&researchinclinicalgastroenterolog,2005,19(1):323.張思維,李連弟,魯風(fēng)珠,等.中國19901992年原發(fā)性肝癌死亡調(diào)查分析j.中華腫瘤雜志,1999,21(4):245249.黃天壬,余家華,張振權(quán),等.廣西肝癌流行特征和流行趨勢(shì)分析j.廣西醫(yī)學(xué),2000,22(4):677679.tangzy,yuyq,zhouxd,eta1.progressandprospectsinhepatocelhlarcarcinomasurgeryj.annchir,1998,52(6):558563.fangzl,lirigr,wangss,eta1.hbvcorepromotermuta-tionsprevailinpatientswithhepatocellularcarcinomafromguangxi,chinaj.jmedvirol,1998,56(1):1824.guangximedicaljom0z,feb.2011,vo1.33,no.27fangzl,yangj,gex,eta1.corepromotermutations(a(1762)tandg(1764)aandviralgenotypeinchronichepatitisbandhepatocellularcarcinomainguansxi,chinaj.jmedvirol,2002,68(1):33一加.8chuchc,haow,tabore.hot-spotmutationsinhepatitisbvirusxgeneinhepatocellularcarcinomaj.lancet,1996.348:625626.9kaojh,chenpj,laimy,eta1.basalcorepromotermuta-tionsofhepatitisbvirusincreasetheriskofhepatocellularcarcinomainhepatitisbcarriersj.gastroenterology,2003,124(2):327334.10liucj,chenbf,chenpj,eta1.roleofhepatitisbviruspreeore/eorepromotermutationsan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