TRPC6在高糖所致足細(xì)胞骨架F-actin損傷.doc

精品論文trpc6 在高糖所致足細(xì)胞骨架 f-actin 損傷中的作用楊賀，趙波，孟可欣，徐佳，廖暢，焦軍東5（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科，哈爾濱 150086）摘要：目的 探討瞬時(shí)受體電位陽離子通道 6（transient receptor potential channel 6， trpc6) 在高糖誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞骨架纖維狀肌動(dòng)蛋白（f-actin）損傷中的作用。方法 以條件永 生性人類腎小球足細(xì)胞為研究對(duì)象，分別采用 real-time pcr，western-blot 印跡技術(shù)觀察高 糖條件下足細(xì)胞 trpc6mrna 和蛋白表達(dá)的變化,通過激光共聚焦法觀察高糖作用下足細(xì)胞10細(xì)胞內(nèi)鈣的變化，以及利用激光共聚焦檢測(cè)技術(shù)觀察高糖條件下足細(xì)胞 f-actin 變化。結(jié)果 real-time pcr 和 western-blot 實(shí)驗(yàn)顯示高糖作用下足細(xì)胞 trpc6 通道蛋白 mrna 和蛋白表 達(dá)明顯上調(diào)；共聚焦數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)顯示，高糖作用下足細(xì)胞內(nèi)鈣明顯增多，高糖條件下足細(xì)胞f-actin 出現(xiàn)重構(gòu)，使用 trpc6 抑制劑后有所恢復(fù)。結(jié)論 高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞細(xì)胞骨架 f-actin發(fā)生損傷，且 trpc6 參與高糖所致的足細(xì)胞骨架 f-actin 損傷。15關(guān)鍵詞：糖尿病腎?。籺rpc6；高糖；腎小球足細(xì)胞中圖分類號(hào)：r587the role of trpc6 in high glucose-induced podocytesf-actin injury20yang he, zhao bo, meng ke xin, xu jia, liao chang, jiao jun dong(department of nephrology,the second affiliated hospital ,harbin medical university, harbin 150086)abstract: objective to investigate the role of trpc6（transient receptor potential channel 6) inglomerular podocytes f-actin injury induced by high glucose. methods the conditionally25immortalized human glomerular podocytes were cultured and the injury was induced by high glucose. using real-time pcr,western-blot and laser scanning confocal microscope to detect the alteration of trpc6 mrna,trpc6 protein, calcium influx and podocytes f-actin under high glucose, respectively. results after high glucose stimulation, the mrna,protein of trpc6 and calcium influx were up-regulated significantly, laser scanning confocal microscope experiments30indicates that high glucose induced podocytes f-actin reorganization which recovered in part after using trpc6 inhibitor; conclusion trpc6 is involved in high glucose-induced podocytes f-actin injury.keywords: diabetic nephropathy; trpc6; high glucose; glomerular podocytes350引言糖尿病腎病（diabetic nephropathy,dn)是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)病率逐年增加，在終 末腎病中所占比例越來越大。關(guān)于糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制，人們?cè)缙陉P(guān)注的是腎小球基質(zhì)堆積， 基底膜增厚，腎小球硬化，腎間質(zhì)纖維化等，然而這僅能解釋部分蛋白排泄率和腎小球?yàn)V過 率的變化1。近年來研究表明，作為腎小球?yàn)V過屏障成分的足細(xì)胞在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中40起到關(guān)鍵作用2-3。瞬時(shí)受體電位陽離子通道 6（trpc6）是瞬時(shí)受體電位陽離子通道（trpc）家族中的 一員，是一種非選擇性的陽離子通道,在人體各組織、器官和細(xì)胞中均有表達(dá)。2005 年，winn基金項(xiàng)目：教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20092307110008）作者簡介：楊賀，（1983-），女，博士研究生 離子通道與腎臟病。通信聯(lián)系人：焦軍東，（1968-），男，教授，離子通道與腎臟病。e-mail: - 6 -等4首次報(bào)道 trpc6 基因突變導(dǎo)致局灶節(jié)段性腎小球硬化 ( focal segmental glomeruloscl erosis, fsgs), 從而揭示了 trpc 通道,尤其 trpc6 與腎臟疾病的密切關(guān)系。最近研究發(fā)現(xiàn)45trpc6 與足細(xì)胞骨架之間也存在聯(lián)系，體外培養(yǎng)的足細(xì)胞 trpc6 高表達(dá)則可以引起 f-actin 解聚和重新分布，但是關(guān)于 trpc6 與高糖所致的足細(xì)胞損傷的研究，目前報(bào)道較少。本實(shí) 驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人腎小球足細(xì)胞為研究對(duì)象，探討 trpc6 在高糖條件下致足細(xì)胞 f-actin 損 傷中的作用。1材料與方法501.1 材料rpmi1640 培養(yǎng)基(hyclone,usa),高容量 cdna 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（abi applied biosystems, usa），trpc6 抗體（alomone labs,israel),fluo-3am(molecular probes eugere or,usa)， thapsigargin(tg),1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol(oag),fitc-phalloidin,2-aminoethoxydiphenylborane(2apb)均購自 sigma-aldrieh 公司（st.louis,mo,usa）。551.2 方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組將復(fù)蘇的足細(xì)胞放入 33c,5%co2 孵箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液成分為 rpmi1640,10% 胎牛血清，以及補(bǔ)充劑（胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉,its）。當(dāng)細(xì)胞生長至 70%-80%融合 時(shí)，轉(zhuǎn)至 37c,5%co2 孵箱中使用相同的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 10-14 天，至細(xì)胞分化完全，選擇60第 5-15 代分化完全的足細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)分組：正常糖組( ng 5. 6mmol/l 葡萄糖)， 高糖組(hg 30 mmol /l 葡萄糖)，以及甘露醇組(m 5.6 mmol /l 葡萄糖 + 24. 4 mmol /l 甘露 醇)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)不同時(shí)間后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2.2real-time pcr 檢測(cè)根據(jù)經(jīng)典的操作規(guī)程，提取足細(xì)胞總 mrna，用分光光度計(jì)測(cè)定樣本中 rna 的純度和65含量，使用高容量 cdna 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒加入 0.5mg 樣本配制成 10ul 混合物，放置于逆轉(zhuǎn)錄 系統(tǒng)中進(jìn)行 cdna 合成，然后將 cdna 樣本在 abiprism 7500 系統(tǒng)中進(jìn)行 real-timepcr 實(shí) 時(shí)定量分析。trpc6 引物序列上游引物：5-gccaatgagcatctggaaat-3；下游引物：5-tggagtcacatcatgggaga-3。在 abiprism 基因分析儀上讀取 real-timepcr 數(shù)據(jù) 結(jié)果。701.2.3western blot 檢測(cè)提取不同組細(xì)胞的總蛋白，低溫離心后取上清，用 bca 法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)樣本取100ug 蛋白進(jìn)行樣品處理后用 10%sds-page 膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜封閉，4c 孵育 trpc6 抗 體及內(nèi)參 -actin 抗體過夜，洗膜，室溫孵育羊抗兔及羊抗鼠二抗 1h，用紅外熒光掃描系統(tǒng) 進(jìn)行檢測(cè)，用 odyssey infrared 成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度積分值分析。751.2.4細(xì)胞內(nèi)鈣檢測(cè)足細(xì)胞培養(yǎng)于多聚賴氨酸涂層的蓋玻片上，70-80%融合后用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液沖洗細(xì)胞 3次，加入用含 fluo3-am(3um),0.03% f-127 的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液 1ml 配置的染料 37c 避光孵育45 分鐘。染色后細(xì)胞使用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鈣變化，與 ca2+結(jié)合的 fluo3 可以被 488nm處激光激發(fā)，可在 525nm 處探測(cè)到熒光發(fā)射。激光掃描共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)胞內(nèi)游離鈣濃度80依賴熒光強(qiáng)度變化，依次加入 1umtg，1.8mmca2+以及 100um trpc6 激動(dòng)劑 oag。胞內(nèi) 鈣離子濃度(ca2+i)以相對(duì)熒光強(qiáng)度表達(dá)。1.2.5f-actin 染色足細(xì)胞培養(yǎng)于多聚賴氨酸涂層的蓋玻片上，用 pbs 清洗后用 4%的多聚甲醛室溫固定15 分鐘，再用 tritonx-100 進(jìn)行穿透，pbs 清洗后用 5ug/ml fitc-phalloidin 室溫避光染色851h,pbs 清洗后，封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍片。1.2.6統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)分析采用 spss16.0 分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以 xs 表示，雙側(cè)檢驗(yàn)以p0.05 判定差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間比較采用配對(duì) t 檢驗(yàn)。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果90951002.1 高糖作用下足細(xì)胞 trpc6mrna 表達(dá)升高實(shí)時(shí)定量 pcr 顯示高糖組與正常糖組相比，在 24h 時(shí)間點(diǎn) trpc6mrna 表達(dá)高于正常 糖組（p0.05),隨著時(shí)間延長 trpc6mrna 表達(dá)逐漸升高，在 48h 升高更加明顯（p0.05),（圖 1）。圖 1 高糖對(duì)足細(xì)胞 trpc6mrna 表達(dá)的影響，與正常糖組相比*p0.05，*p0.01。fig1 the effect of high glucose on trpc6mrna in podocyte, *p0.05, *p0.01 versus ng.2.2 高糖作用下足細(xì)胞 trpc6 蛋白表達(dá)水平升高western-blot 結(jié)果顯示，與正常糖組相比，在 24h 時(shí)間點(diǎn)高糖組 trpc6 蛋白表達(dá)明顯增 高（p0.05）,隨高糖作用時(shí)間延長，trpc6 蛋白表達(dá)逐漸升高，至 48h 升高明顯（p0.05）,（圖 2）。105110115120125圖 2 高糖對(duì)足細(xì)胞 trpc6 蛋白表達(dá)的影響。上圖為 trpc6 蛋白表達(dá)，下圖為相應(yīng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，n=3。*，與正常糖組相比 p0.05，*，與正常糖組相比 p0.01。fig2 the effect of high glucose on trpc6 protein in podocyte. trpc6 protein level (above),corresponding statistical data (below). data are expressed as mean sem n=3.*p0.05, *p0.01 versus ng.2.3 高糖作用下足細(xì)胞鈣內(nèi)流增加在靜止的細(xì)胞內(nèi)，ca2+主要通過兩種機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，一種是鈣池調(diào)控鈣離子內(nèi)流（store-operated calcium entry,soce）,另一種是受體介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流（receptor- operated calcium entry,roce）.tg 可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵引起鈣池被動(dòng)性排空，從而激活 soce，研究證 實(shí) trpc6 可以被 dag 所激活，使 ca2+通過 roce 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。我們用 dag 類似物 oag 檢測(cè)高糖對(duì)足細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高糖增加 oag 誘導(dǎo)的 roce(p0.05),（圖 3）。圖 3 高糖對(duì) tg 誘導(dǎo)的 soce 和 oag 誘導(dǎo)的 roce 的影響.a 為單個(gè)細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)過程中代表曲線。b,c 為 多次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高糖增加 oag 誘導(dǎo)的 roce(*p0.05,vs 正常糖組，n=5)。fig3 the effects of high glucose on tg-induced soce and oag-induced roce.representative traces (a)and summary data (b,c) showing that high glucose enhance oag-induced roce(*p0.05 versus ng,n=5).2.4 trpc6 參與高糖作用下 f-actin 的重排正常條件培養(yǎng)足細(xì)胞，f-actin 經(jīng) fitc-phalloidan 染色后，顯示 f-actin 被染成黃綠色的 長條細(xì)絲狀貫穿于細(xì)胞全長。經(jīng)過高糖作用后，細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞內(nèi) f-actin 出現(xiàn)斷裂重 排，應(yīng)用 trpc6 非選擇性抑制劑 2apb 后，高糖所致的 f-actin 重排有所恢復(fù)，（圖 4）。130135圖4 trpc6 在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞 f-catin 重組中的作用(400).在 ng 和 m 組，f-actin 染色顯示細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白呈明顯規(guī)律的肌纖維樣排列。hg 作用后肌動(dòng)蛋白明顯重排，預(yù)孵育 100m 2-apb 改變了這一高糖導(dǎo)致 的形態(tài)學(xué)變化。fig4 the role of trpc6 in high glucose-induced f-actin reorganization(400).in ng and m groups ,a striking organization of stress fibers were showed.hg lead to reorganization,pretreatment of 100m 2-apb attenuated the morphological changes.1401451501553討論糖尿病腎病中足細(xì)胞出現(xiàn)損傷，表現(xiàn)為足細(xì)胞密度數(shù)量的減少，足細(xì)胞肥大變性及足突 融合消失，足細(xì)胞骨架損傷在 dn 疾病發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，但是關(guān)于足細(xì)胞骨架 損傷的機(jī)制并不明確。trpc6 是 trp 超家族中的一員，是一種非選擇性陽離子通道，winn 等利用免疫熒光首次發(fā)現(xiàn) trpc6 在正常人腎小球和腎小管表達(dá)。reiser 等5通過激光共聚 焦進(jìn)一步證實(shí)，trpc6 在腎小球主要表達(dá)在足細(xì)胞。moller 等6發(fā)現(xiàn)在人類非選擇性蛋白尿 性疾病如 fsgs、微小病變性腎病和膜性腎病患者中，trpc6 表達(dá)顯著增加,他們還發(fā)現(xiàn) trpc6 表達(dá)增加可致足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架分子重排和鈣離子重新分布。然而，目前關(guān)于 trpc6 在糖尿病腎病足細(xì)胞骨架損傷中的作用研究較少。足細(xì)胞是一種高度特異性，終末分化細(xì)胞，呈線狀分布于腎小球基底膜的外部，構(gòu)成阻 止蛋白漏出的最終屏障，在其分化的成熟階段，足突與足突相接形成裂孔隔膜7。足細(xì)胞功 能的正常維持有賴于足突間的裂孔隔膜蛋白 nephrin、podocin 和 cd2ap 等的正常定位和相 互作用，trpc6 表達(dá)于足細(xì)胞的細(xì)胞體并且與 nephrin、podocin cd2ap 等其它裂隙隔膜蛋 白共同表達(dá)于相鄰兩個(gè)足細(xì)胞膜結(jié)合區(qū)域5,8，而且有研究也表明在 nephrin 基因缺失的小鼠 中足細(xì)胞裂孔隔膜斷裂，trpc6 過表達(dá)并且其分布也出現(xiàn)變化，這就表明 trpc6 是位于足 細(xì)胞裂孔隔膜上的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體的一個(gè)組成部分，而這個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體對(duì)于維持足細(xì)胞 正常功能起重要作用。donblier 等研究顯示，dn 早期存在 nephrin 表達(dá)異常和重新分布9。 新近研究表明在糖尿病腎病活檢的患者足細(xì)胞中 trpc6 表達(dá)升高10。細(xì)胞骨架是維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的核心因素，對(duì)于足細(xì)胞細(xì)胞骨架的持續(xù)性調(diào)節(jié)是維 持腎小球?yàn)V過屏障的至關(guān)重要的因素11。足細(xì)胞骨架主要由微絲蛋白，中間絲蛋白，微管 蛋白三種不同的超微結(jié)構(gòu)組成。研究足細(xì)胞骨架改變往往以沿足突連續(xù)性表達(dá)的微絲蛋白 f-actin 作為代表。正常細(xì)胞中球狀肌動(dòng)蛋白（g-actin）與 f-actin 不斷轉(zhuǎn)換，達(dá)到平衡，并且只有聚合態(tài)的肌動(dòng)蛋白才具有生物學(xué)作用。siu 等研究發(fā)現(xiàn)高糖和糖基化終末產(chǎn)物可導(dǎo)致dn 腎小球足細(xì)胞骨架破壞12gracem.mitu 發(fā)現(xiàn)高糖作用足細(xì)胞后足細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞間160165170175180185190195200205聯(lián)系減少，f-actin 出現(xiàn)重排13。最近研究發(fā)現(xiàn) trpc6 與足細(xì)胞骨架之間也存在聯(lián)系，體外 培養(yǎng)的足細(xì)胞 trpc6 高表達(dá)則可以引起 f-actin 解聚和重新分布5。研究表明 trpc6 激活 后可導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增多，進(jìn)而激活鈣離子依賴的磷酸化并且分解裂孔隔膜，改變了足細(xì)胞 足突的收縮結(jié)構(gòu)，從而造成濾過系數(shù)的變化，最終會(huì)導(dǎo)致蛋白尿。本實(shí)驗(yàn)使用高糖作用于人腎小球足細(xì)胞,應(yīng)用 real-time pcr 和 western-blot 檢測(cè)技術(shù)表 明，與正常糖組相比高糖組 trpc6mrna,蛋白表達(dá)明顯增高，細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流增加。高糖作用后足細(xì)胞 f-actin 出現(xiàn)重排，使用 trpc6 抑制劑后 f-actin 改變有所恢復(fù)，表明 trpc6參與了高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞 f-actin 損傷。高糖導(dǎo)致足細(xì)胞 trpc6 表達(dá)升高的機(jī)制目前還不明確，許多研究表明氧化應(yīng)激在高糖 引起 dn 的信號(hào)通路中起到重要作用14-16，在未來的實(shí)驗(yàn)中，我們會(huì)探討氧化應(yīng)激與 trpc6 通道蛋白的關(guān)系。綜上所述，高糖能導(dǎo)致體外培養(yǎng)的人腎小球足細(xì)胞 f-actin 改變，trpc6 可能在其損傷過程中起到一定作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn) (references)1 mclennan sv,fishere,martell sy,et al.effect of glucose on matrix metalloproteinase and plasmin activite in mesangial cells;possible role 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