生物：1.2《基因工程的基本操作程序》ppt(新人教版選修3)-副本.ppt

基因工程的基本操作程序,原核細胞的基因結(jié)構(gòu)(補充內(nèi)容）,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點,啟動子,終止子,不編碼蛋白質(zhì)。,：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細胞的 基因結(jié)構(gòu),調(diào)控遺傳信息表達,上 游有啟動子，下游有終止子,真核細胞的基因結(jié)構(gòu)（補充內(nèi)容）,編碼區(qū),與RNA聚合酶 結(jié)合位點,內(nèi)含子,外顯子,啟動子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,真核細胞的 基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列 內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用,上游有啟動子，下游有終止子,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,基因的種類,（1）編碼蛋白質(zhì)的基因：包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。 （2）沒有轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。 （3）不能轉(zhuǎn)錄的DNA片段：如操縱基因。,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,基因操作的基本步驟,目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。,一、目的基因的獲取,目的基因,1.目的基因主要是指_,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,2、獲取目的基因的常用方法,（1）從基因文庫中獲取,（2）利用PCR技術擴增,（3）人工合成,1.概念：基因文庫 （gene library）,將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(gene library),基因組文庫的構(gòu)建,（2）.基因文庫的構(gòu)建方法,通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因, cDNA文庫的構(gòu)建-反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,目的基因的mRNA,單鏈DNA,反轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,雙鏈DNA (目的基因),基因組文庫: 基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫. 部分基因文庫: 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.,基因組文庫與部分基因文庫的關系,提取某種生物的全部DNA,用適當?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,導入受體菌中儲存,基因組文庫,2基因文庫的構(gòu)建方法之一,（1）直接分離法(鳥槍法),某種生物的單鏈mRNA,單鏈互補DNA,雙鏈cDNA片段,導入受體菌中儲存,與載體連接,cDNA文庫,逆轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,cDNA合成過程,第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。 第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。,3.如何從基因文庫中得到所需要的基因？,依據(jù)：目的基因的有關信息。,如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 基因的翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì) 等特性。,4.為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？,構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。,2.利用PCR技術擴增目的基因,PCR多聚酶鏈式反應 是一項生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。通過此技術，可獲取大量的目的基因。,PCR技術,原理： 前提： 原料 方式,PCR擴增儀,DNA復制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式擴增， 即_（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2n,模板DNA； DNA引物； 四種脫氧核苷酸； 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；離子,過程,變性、退火、延伸三步曲,變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA 退火：冷卻至5560引物與部分模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合 延伸：加熱至7075以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈,2、具體過程,3. 人工合成,根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,推測,推測,目的基因,化學合成,二.基因表達載體的構(gòu)建核心,質(zhì)粒,DNA分子,一個切口 兩個黏性末端,兩個切口 獲得目的基因,DNA 連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,同一種 限制酶,目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。,目的： 組成：,1、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代， 2、使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,目的基因+啟動子+終止子+標記基因+復制原點,基因工程載體的構(gòu)建需要考慮哪些因素,（1）基因的特點：如果一個來自動物的目的基因含有內(nèi)含子，就不能用于轉(zhuǎn)基因植物，因為動物中內(nèi)含子的剪接系統(tǒng)與植物的不同，植物不能將動物基因的內(nèi)含子剪切掉，只能用該基因的cDNA?；虻漠a(chǎn)物如果是一個糖蛋白，那么該基因在原核生物細菌中表達出來的蛋白就可能不具備天然狀態(tài)下的活性，因為糖蛋白上的糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加上的，而細菌無這些細胞器。 （2）要選擇強啟動子或組織特異性啟動子。啟動子有強有弱，選擇強啟動子可以增加轉(zhuǎn)錄活性，使基因產(chǎn)物量增多。如果希望基因在生物的某個組織表達，如只在植物種子中表達，就要選擇種子中特異表達的啟動子。 （3）要有選擇標記基因，如抗生素基因，以便選擇出真正的轉(zhuǎn)基因生物。,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來,載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵 啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少 目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。,注意,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,（一）轉(zhuǎn)化：,（二）方法,將目的基因?qū)?植物細胞,將目的基因?qū)?動物細胞,將目的基因?qū)?微生物細胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細胞,目的基因進入_內(nèi)，并且在 受體細胞內(nèi)維持_和_的過程,受體細胞,穩(wěn)定,表達,1、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ?（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力,原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。,過程：,（2）基因槍法 （3）花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱游锛毎?方法：顯微注射法 程序：,目的基因表達載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動物,3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少 方法：,用Ca2+處理細胞 感受態(tài)細胞 表達載體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)細胞吸收DNA分子,四、目的基因的檢測與鑒定,檢查是否成功,目的基因的檢測與鑒定,檢測: 是否插入目的基因 是否轉(zhuǎn)錄 是否翻譯 鑒定: 功能活性鑒定 抗性鑒定,分別提取什么進行檢測,歸納步驟,（一）、檢測,1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 (關鍵步驟),首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中,（1）方法:,DNA分子雜交,（2）過程:,知識延伸DNA分子雜交技術,該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學發(fā)光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。,歸納步驟,（二）、鑒定（個體生物學水平）,2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分 子 雜 交,方法:,抗原抗體雜交,過程: 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA,歸納步驟,(四)目的基因的檢測與鑒定,檢查是否成功,檢測,鑒定,檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗