血清堿性磷酸酶活性測定(第一組).ppt

血清堿性磷酸酶活性測定,磷酸本二鈉法,酶活力測定與酶法分析,酶活力測定 酶活力：即是酶活性，是表示催化某一特定反應的能力?？梢杂迷谝欢l件下所催化的某一特定化學速度表示。 酶催化反應速度越快，酶活性 ，反之則愈低。 底物減少量或生成物增加量 酶促反應速度= 單位時間,影響酶促反應速度的因素包括底物濃度、酶濃度、ph值、溫度、激活劑、抑制劑等。 酶活力單位指：在特定條件下1分鐘能將1微摩爾底物轉化為底物所需酶量，或轉化底物中1微摩爾的有關基團的酶數。 酶的比活力：單位質量酶蛋白或單位體積酶制劑所含有酶活力單位數。 方法： 1.終止測定法（定時法或終點法） 2.動力學分析法（連續(xù)監(jiān)測法或速率法） 3.物質含量的測定方法,酶法分析 ！指應用酶作為工具定量測定某種物質含量的分析方法。 （一）單酶反應定量法 1、直接測定底物的含量 2、由輔酶變化量測定底物量 （二）偶聯酶反應定量法 E1 E2 A B C,酶活力測定和酶法分析在醫(yī)學上的應用,實驗目的,1.熟悉酶活性測定方法的一般原理 2.掌握血清ALP測定原理與臨床意義 3.熟悉終止法和動力學測定法,實驗原理 在PH10 環(huán)境中，ALP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，苯酚與4-氨基安替比林反應生成色素原，該色素原經鐵氰化鉀氧化生成紅色醌亞衍生物。測定紅色物質的吸光度就可以計算酶活性的大小。 反應式如下： 磷酸苯二鈉+H2O苯酚+磷酸氫二鈉 苯酚+4-氨基安替比林紅色醌亞胺衍生物,實驗器材和試劑： （一）器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可調式移液器，721E分光光度計，1cm比色皿，37 恒溫水浴 （二）試劑： 10.1mol/L碳酸鹽緩沖液(pH10.0) 稱取無水碳酸鈉6.36g，碳酸氫鈉3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于800ml蒸餾水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。 220mmol/L磷酸苯二鈉溶液 先將500ml蒸餾水煮沸，稱取磷酸苯二鈉2.18g(磷酸苯二鈉如含2分子結晶水，則應稱取2.54g)加入煮沸的蒸餾水中使其溶解，冷卻后用煮過的冷蒸餾水加至500ml，再加氯仿2ml，置冰箱保存，此為底物溶液。 3鐵氰化鉀的硼酸溶液 稱取鐵氰化鉀2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸餾水400ml中，兩液混合后，加蒸餾水至1 000ml，置棕色瓶中避光保存(如出現藍綠色即棄去)。 4酚標準工作液（0. 05mg/ml）：購買合格的二級標準品。,實驗操作,取試管4支，按下表操作：,立即混勻。用510nm波長比色，以蒸餾水調零點，讀取各管吸光度。 計算 ALP活性=（A測定A對照）/（A標準A空白）*0.05*100(金氏單位）,臨床意義 在臨床上，血清ALP測定常作為肝膽疾病和骨骼疾病的臨床輔助診斷指標。 1血清ALP活性升高 ： 肝膽疾?。鹤枞渣S疸、急性或慢性黃疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾?。河捎诠堑膿p傷或疾病使成骨細胞內所含高濃度的ALP釋放進入血液中，引起血清ALP活性增高，如纖維性骨炎、成骨不全癥、佝僂病、骨軟化病、骨轉移癌和骨折修復愈合期等。 2血清ALP活性降低： 比較少見，主要見于呆小病，ALP過少癥，維生素C缺乏癥。,注意事項 1底物溶液中不應含有游離酚，如有酚則空白管顯紅色，說明磷酸苯二鈉已經開始分解，應棄去不用。 2鐵氰化鉀溶液中加入硼酸有穩(wěn)定顯色作用。該液應避光保存，如出現藍綠色即應廢棄。 3加入鐵氰化鉀溶液后必須立即混勻，否則顯色不完全。 4黃疸血清及溶血血清應分別作對照管，一般血清標本可以共用對照管,標準曲線法 制備如下： 取試管6支，分別加酚標準液(1ml=01mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各管依次加復合基質液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、2.7ml?；靹蚝?7水浴保溫5分鐘，各管加入1.0ml堿性溶液，再加0.5鐵氰化鉀2.0ml