分子發(fā)光分析法講義.ppt

第五章 分子發(fā)光分析法 （Molecular luminescence analysis),5-1 概述 5-2 熒光分析法 5-3 磷光分析法 5-4 化學(xué)發(fā)光分析法,基態(tài)分子吸收了一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài)。當(dāng)激發(fā)態(tài)分子以輻射躍遷形式將其能量釋放返回基態(tài)時(shí)，便產(chǎn)生分子發(fā)光。,化學(xué)發(fā)光Chemiluminescence,場致發(fā)光,熱致發(fā)光,光致發(fā)光 Photoluminescent,磷光Phosphorescence,熒光Fluorescence,5-1 熒光分析法 分子熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的分子熒光光譜進(jìn)行定性，以熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量的一種分析方法。 一、基本原理： （一）、分子熒光（磷光）的產(chǎn)生： 室溫下，大多數(shù)分子處在基態(tài)的最低振動能層。處于基態(tài)的分子吸收能量（電能、熱能、化學(xué)能或光能）后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)。若返回到基態(tài)時(shí)伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光”。,單重態(tài)，激發(fā)單重態(tài)，三重態(tài)：,去活化過程：處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，它可能通過輻射躍遷和非輻射躍遷等去活化過程返回基態(tài)。 由較高能態(tài)到較低能態(tài)的過程( ) 其中，以速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢。,去活化過程： 、振動馳豫（VR） 在同一能級中，分子由較高振動能級向該電子態(tài)的最低振動能級的非輻射躍遷。其速率極大，10-1410-12s內(nèi)即可完成。 、內(nèi)轉(zhuǎn)換（ic） 指相同多重態(tài)的兩個(gè)電子態(tài)之間（S2 S1，S1 S0）的非輻射躍遷。當(dāng)兩個(gè)電子能級非?？拷灾疗湔駝幽芗売兄丿B時(shí)，常發(fā)生電子由高能級以無輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級。如圖中S2的較低振動層與S1的較高振動層相重疊，分子無論在哪一個(gè)激發(fā)單重態(tài)，都能通過振動馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化躍回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。, 1 2 3,1,2,2,VR,1,VR,ic,isc,F,P,（3）、體系間竄躍（isc） 指不同多重態(tài)的兩個(gè)電子之間的非輻射躍遷。 它涉及受激發(fā)電子自旋狀態(tài)的改變，如S1 T1，使原來兩個(gè)自旋配對的電子不再配對，這種躍遷是禁阻躍遷。 含有重原子（碘、溴等）的分子中，體系間跨越躍遷最為常見。 在溶液中存在如氧分子等順磁性物質(zhì)也能增加體系間跨越的發(fā)生，因而使熒光減弱。,4）、熒光發(fā)射（Fluorescence） 當(dāng)分子處于單重激發(fā)態(tài)的最低振動能級時(shí)，去活化過程的一種形式是以10-910-6s左右的短時(shí)間發(fā)射一個(gè)光子返回基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射。 （單重單重，停10-910-6s ） 發(fā)射熒光的能量比分子所吸收的能量要小，即熒光的特征波長比它所吸收的特征波長要長。 注意：基態(tài)中也有振動馳豫躍遷。31或2 ，不論電子開始被激發(fā)至什么高能級，最終將只發(fā)射出波長為3的熒光。,（5）、磷光發(fā)射（Phosphorescence） 從單重態(tài)到三重態(tài)的分子體系間竄躍發(fā)生后，接著發(fā)生快速的振動馳豫而到達(dá)三重態(tài)的最低能層上，此時(shí)可能由兩種途徑返回基態(tài)： 體系間竄躍 在10-410s左右時(shí)間內(nèi)輻射躍遷回基態(tài)而發(fā)生磷光.這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。 （三重單重，停10-4-10s，液氮冷凍試樣，才可見磷光） 熒光和磷光的根本區(qū)別: 熒光是由單重-單重躍遷引起的， 磷光則由三重-單重躍遷產(chǎn)生的。,觀察磷光現(xiàn)象時(shí)，試樣要用液氮冷凍 a.三重態(tài)與基態(tài)之間的能量差要比最低激發(fā)態(tài)和基態(tài)之間的能量差小，這使三重態(tài)與基態(tài)之間的振動偶合增強(qiáng)，因而增強(qiáng)了內(nèi)部轉(zhuǎn)換； b.激發(fā)三重態(tài)的壽命比激發(fā)單重態(tài)的壽命長，因而同溶劑分子碰撞而失去激發(fā)能的可能性增大，以致在室溫條件下不能觀察到溶液的磷光。 因此，觀察磷光現(xiàn)象時(shí)，試樣要用液氮冷凍以使碰撞去活化和振動偶合去活化降至最低限度,?, 1 2 3,1,2,2,VR,1,VR,ic,isc,F,P,（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 1、激發(fā)光譜：熒光和磷光都是光致發(fā)光，因此必須選擇合適的激發(fā)光波長，這可從他們的激發(fā)光譜曲線來確定 以熒光（磷光）的最大發(fā)射波長為測量波長，改變激發(fā)光的波長，測量熒光強(qiáng)度的變化，以激發(fā)光波長為橫座標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)作圖，即可得到激發(fā)光譜。,相對強(qiáng)度,萘的激發(fā)光譜 熒光光譜 磷光光譜,相對強(qiáng)度,熒光或磷光光譜曲線: 固定激發(fā)光波長為其最大激發(fā)波長，然后測定不同的波長時(shí)所發(fā)射的熒光或磷光強(qiáng)度，將熒光的光波長為橫座標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)作圖便可得到熒光光譜（發(fā)射光譜）。,2、激發(fā)光譜和熒光光譜的特點(diǎn)： （1）熒光光譜的形狀與激發(fā)光波長無關(guān) 熒光物質(zhì)吸收不同波長的激 發(fā)光可被激發(fā)到不同能態(tài)，通過 振動馳豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)換最終都將達(dá) 到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能 級，然后再發(fā)射熒光。故蒽的激 發(fā)光譜雖在250nm和350nm有兩 個(gè)峰，不論用哪一個(gè)峰的波長作 激發(fā)光源，所得熒光光譜的形狀 和峰的位置都是相同的。,（2） 熒光光譜和激發(fā)光譜成鏡像關(guān)系 從圖可看出激發(fā)光譜同熒光光 譜大致成鏡像對稱 a. 熒光光譜(發(fā)射光譜）形狀 與基態(tài)S0振動能級的分布情況 （即能量間隔情況）有關(guān) b. 激發(fā)光譜(吸收譜)形狀與 激發(fā)態(tài)S1振動能級的分布有關(guān),c. S0、S1態(tài)中振動能級的分布是相似的(說明峰形狀相 似） d. 根據(jù)Frankcondon原理，電子躍遷過程中核的相對位置不變（近似的），若吸收光譜中某一振動帶的躍遷幾率最大，則在熒光發(fā)射光譜中，其相反躍遷的幾率也應(yīng)最大(說明高峰對高峰，低峰對低峰） 非鏡像對稱的峰出現(xiàn)，則表示有散射光或雜質(zhì)存在。,（3）熒光光譜波長em大于激發(fā)光譜波長ex 斯托克斯（Stokes）于1852年首次觀察到熒光光譜波長em大于激發(fā)光譜波長ex這一現(xiàn)象（稱斯托克斯位移）。它說明激發(fā)與發(fā)射間有一定能量損失。產(chǎn)生的主要原因是激發(fā)態(tài)分子發(fā)射前后都存在振動弛豫現(xiàn)象。,例: 區(qū)別譜圖中的 三個(gè)峰，說明判斷 原則。,（三）、熒光效率及其影響因素： 1、分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件： 、分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，才能吸收激發(fā)光； 、吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率（熒光效率）,、熒光效率,熒光效率越高，輻射躍遷概率就越大，物質(zhì)發(fā) 射的熒光也就越強(qiáng)。 、熒光效率也可用各種躍遷的速率常數(shù)來表示,Kf：表示熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，主要取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)； ：表示非輻射躍遷的速率常數(shù)之和，主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。,2、熒光效率,3、熒光效率的影響因素： 、分子結(jié)構(gòu)： a、躍遷類型： 實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)熒光化合物都是由*或n *躍遷激發(fā)，然后經(jīng)過VR或其它無輻射躍遷，再發(fā)生* 或* n躍遷而產(chǎn)生熒光。其中 *躍遷的熒光效率較高。 原因：的較大（比n大100-1000倍），其次，壽命約10-710-9s(比n壽命10-510-7s短)，此外，在過程中，體系間竄躍至三重態(tài)的速率常數(shù)也較小，這都有利于熒光的發(fā)射。,b、共軛效應(yīng)：含有*躍遷能級的芳香族化合物的熒光最強(qiáng)；這種體系中的電子共軛度越大，則電子的離域性越強(qiáng)，越易被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，而且熒光光譜將向長波移動。所以絕大多數(shù)能發(fā)生熒光的物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán)。 對苯基化、間苯基化和乙烯化作用都將增加苯的熒光強(qiáng)度，并使熒光光譜紅移。,c、剛性平面結(jié)構(gòu)：此結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減小，也就減少了碰撞去活的可能性，有利于熒光的產(chǎn)生。 例1：熒光素有很強(qiáng)熒光，但酚酞無，是由于 熒光素的剛性可減少分子振動,例2：芴和聯(lián)苯在同樣條件下的熒光效率約為1.0和0.2。,芴上的亞甲基增強(qiáng)了分子的剛性。此外，當(dāng)熒光染料吸附在固體表面上時(shí)，常使熒光發(fā)射增強(qiáng)，這可用固體表面誘導(dǎo)了分子結(jié)構(gòu)的附加剛性來說明。,例3：剛性的影響可說明螯合劑同M螯合時(shí)熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象。 滂鉻蘭黑R（BBR）無熒光，它與鋁形成螯合物有熒光。,d、取代基效應(yīng)： 給電子取代基使共軛體系增大，使熒光增強(qiáng)，如 OH，NH2，NR2，OR，CN。 吸電子取代基使熒光減弱甚至?xí)鐭晒猓?COOH，NO，NO2，C=O，鹵素離子等。 同電子體系相互作用小的取代基（SO3H， NH3+和烷基），對分子發(fā)光影響小。 重原子效應(yīng)：將一高原子序數(shù)的原子引入到電 子體系中去，往往會使物質(zhì)的熒光減弱，而磷光增強(qiáng)。,重原子效應(yīng)： 若使用含重原子的溶劑，也會發(fā)生外部重原子效應(yīng)，導(dǎo)致磷光增強(qiáng)和熒光減弱。 如 鹵素取代基 熒光的相對強(qiáng)度 氟代苯 10 氯代苯 7 溴代苯 5 碘代苯 0 原因：因?yàn)樵谠有驍?shù)高的原子中，電子自旋和軌道運(yùn)動間的相互作用變大，更有利于電子自旋的改變，增大了體系間竄躍，而使熒光減弱，磷光增強(qiáng)。,、環(huán)境因素： A、溶劑的極性：極性增加，對激發(fā)態(tài)會產(chǎn)生更大的 穩(wěn)定作用，結(jié)果使物質(zhì)的熒光波長紅移，熒光強(qiáng) 度增大。 B、溫度：輻射躍遷的速率基本不隨溫度而變； 非輻射躍遷的速率隨溫度升高而顯著地增大； 因此，升高溫度會使非輻射躍遷概率增大，熒光效 率降低。 C、pH值：影響酸性、堿性取代基團(tuán)的存在型體，應(yīng) 嚴(yán)格控制pH。 如苯胺在pH=712時(shí)以分子型體存在，發(fā)蘭色熒光，而pH小于2、pH大于13時(shí)以離子形式存在，不發(fā)生熒光。 D、表面活性劑：增大熒光效率 E、順磁性物質(zhì)：減小熒光效率如O2。,（四）熒光強(qiáng)度同濃度的關(guān)系 1、熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率 。 If = Ia 據(jù)Beer定律： Ia = I0 - It = I0(1- 10 -A) 代入上式得： If = I0(1- 10 -A) = I0(1- 10 - b c) 若溶液很稀(A0.05），則可近似為 If =2.3 I0 bc 對于一給定的物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長和強(qiáng)度一定時(shí)，熒光強(qiáng)度只與溶液濃度有關(guān)。 If = K c 熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比,2、高濃度偏離線性關(guān)系的因素： a. 當(dāng)濃度較濃，不滿足A0.05，公式近似處理誤差大 （如果a=104，b=1.0 代入abc0.05 得c=5.010-6mol/L) b. 自猝滅（Self-quenching）由熒光分子間以及熒光分子同溶劑分子間的碰撞產(chǎn)生的。 c ，自猝滅。 c. 自吸收（Self-absorption）發(fā)生在熒光發(fā)射波長同化合物的吸收峰重迭的情況下，當(dāng)熒光通過溶液時(shí)便被吸收一部分。,3、影響熒光強(qiáng)度的因素： 內(nèi)濾光作用和自吸收現(xiàn)象： 溶液中若存在著能吸收激發(fā)或熒光物質(zhì)所發(fā)射光能的物質(zhì)，就會使熒光減弱。 熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜的短波長一端與該物質(zhì)的吸收光譜的長波長一端有重疊，在溶液濃度較大時(shí)，一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產(chǎn)生“自吸收”現(xiàn)象而降低了溶液的熒光強(qiáng)度。,熒光猝滅（熒光熄滅）： 廣義的說，指任何可使物質(zhì)熒光強(qiáng)度下降的作用，任何可使熒光強(qiáng)度不與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系的作用，或任何可使熒光量子產(chǎn)率降低的作用。 狹義的說，指熒光分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子之間所發(fā)生的導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的物理或化學(xué)作用過程。 熒光猝滅劑：與熒光物質(zhì)分子發(fā)生相互作用而引起熒光強(qiáng)度下降的物質(zhì)。,(1).動態(tài)猝滅 猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生的相互作用過程(能量轉(zhuǎn)移過程等），可生成瞬時(shí)激發(fā)態(tài)復(fù)合物（不發(fā)射熒光，或熒光的發(fā)射特性與原先的熒光物質(zhì)不同），從而引起熒光猝滅現(xiàn)象。動態(tài)猝滅的效率受熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)分子的壽命和猝滅劑的濃度限制。 1-萘胺的熒光在堿性溶液中發(fā)生猝滅現(xiàn)象，但它的吸收光譜并無變化，這是動態(tài)猝滅的一個(gè)例子。,(2).靜態(tài)猝滅 猝滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)發(fā)生配合反應(yīng)，降低了熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。 動態(tài)猝滅中的熒光量子產(chǎn)率由光反應(yīng)動力學(xué)控制，靜態(tài)猝滅中的熒光量子產(chǎn)率只受基態(tài)的配位作用的熱力學(xué)所控制。,(3).猝滅劑 氧能使多數(shù)熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光猝滅現(xiàn)象。 胺類是大多數(shù)未取代的芳烴的有效猝滅劑。 鹵素化合物、重金屬離子以及硝基化合物等，也是常見的猝滅劑。鹵素離子對奎寧有顯著的猝滅作用。但對某些物質(zhì)卻無猝滅作用。這表明猝滅劑和熒光物質(zhì)分子之間的相互作用是有一定選擇性的。,(4)自猝滅：當(dāng)熒光物質(zhì)濃度超過1g/L時(shí)，常發(fā)生熒光的自猝滅（濃度猝滅）現(xiàn)象。 可能的原因： a. 熒光輻射的自吸收，這在熒光物質(zhì)的吸收光譜和發(fā)射光譜有較大重疊時(shí)較嚴(yán)重。 b. 熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子M*與基態(tài)分子M形成激發(fā)態(tài)的二聚體（M*M）。 c. 基態(tài)的熒光物質(zhì)分子的締合。熒光自猝滅是與濃度有關(guān)的效應(yīng)，因而通過在熒光測定前稀釋溶液的辦法，可避免這一現(xiàn)象的發(fā)生，或減小它所產(chǎn)生的影響。,二、熒光分析儀器示意圖,1、與分光光度計(jì)的差別： 、熒光分析儀器采用垂直測量方式； 、熒光分析儀器有兩個(gè)單色器，一個(gè)是激發(fā)單色器，置于液槽前，用于獲得單色性較好的激發(fā)光；另一個(gè)是發(fā)射單色器，置于液槽和檢測器之間，用于分出某一波長的熒光。 2、儀器各部分簡介： 光源 激發(fā)單色器 液槽 發(fā)射單色器 檢測器 記錄儀,激發(fā)光源 作用：提供連續(xù)輻射，激發(fā)樣品 要求：光源（I0）強(qiáng)度足夠；強(qiáng)度與波長無關(guān) 種類： 鹵鎢燈，高壓汞燈，氙弧燈。 激發(fā)單色器- 作用：用于選擇激發(fā)光的波長,樣品池 用石英制成 形狀:正方形、長方形、圓形的。低溫測定時(shí)在石英液槽外套一個(gè)盛放液氮的透明石英真空瓶。 發(fā)射單色器 用于選擇投射到檢測器的熒光波長。 檢測器 熒光或磷光的強(qiáng)度較弱，要求檢測器靈敏度高。 光電管，光電倍增管,三、熒光分析方法及應(yīng)用,1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法 用已知的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣同樣的處理后，配成一系列標(biāo)液。測定標(biāo)液的熒光強(qiáng)度，用熒光強(qiáng)度對標(biāo)液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)試液的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。,2.熒光分析法的靈敏度：比吸光法高得多，更適合于低濃度物質(zhì)的分子。 這兩種方法在靈敏度方面的差別主要是由于同濃度相關(guān)的參數(shù)的測量方式不同。 在光度計(jì)中，同濃度相關(guān)的參數(shù)A是I0/I的對數(shù)。在測低濃度液時(shí)，檢測器必須能區(qū)分I、I0訊號的微小差別，故在低A時(shí)測量的精確度迅速降低。,而熒光強(qiáng)度F（或磷光強(qiáng)度P）直接同熒光（磷光）物質(zhì)的濃度成正比。同濃度相關(guān)的參數(shù)是在很小噪聲背景上的熒光（磷光）發(fā)射訊號本身，可用增強(qiáng)入射光強(qiáng)度I0或增大熒光訊號的放大倍數(shù)來提高靈敏度。而在光度法中, 若檢測器放大倍數(shù)，I0及I同時(shí)， A值不變。 故熒光法靈敏度常比相應(yīng)光度法高2-4個(gè)數(shù)量級。,3. 熒光分析法的選擇性 很多分子在紫外可見區(qū)有吸收，但其中只有一部分能再發(fā)射熒光或磷光，故熒光法固有干擾很少，選擇性較好。,4熒光分析法的應(yīng)用,5 3 磷光分析法,一、 概述 磷光的產(chǎn)生涉及到激發(fā)單重態(tài)至激發(fā)三重態(tài)和由激發(fā)三重態(tài)經(jīng)禁阻躍遷回到基態(tài)，易受其它輻射或無輻射躍遷的干擾而使磷光強(qiáng)度減弱，甚至完全消失。因此，為獲得較強(qiáng)磷光，宜采取下列措施： 1、增加試樣的剛性可減小質(zhì)點(diǎn)間的碰撞幾率，以減小無輻射躍遷。低溫磷光就是基于這一原理建立起來的。通常，將被分析試樣的乙醚或異戊醇溶液置于液氮中（或用二乙醚，異戊烷和乙醇按5：5：2混合稱EPA混合溶劑），讓其冷凍至玻璃狀態(tài)后，即可測定磷光。,2、室溫磷光： 固體磷光法 在薄層色譜板上分析斑點(diǎn)磷光，可將被分析物質(zhì)直接固定在薄層色譜板上，而將任何液體溶劑除去。理想的載體應(yīng)是既能將分析物牢固地束縛在表面或基體中以增強(qiáng)磷光強(qiáng)度，本身又不產(chǎn)生背景。常用的是濾紙和纖維素色層紙。 分子締合物的形成 在試液中，表面活性劑與被測物形成膠束締合物后，可增強(qiáng)其剛性，減小因碰撞而引起的能量損失。例表面活性劑十二烷基硫酸鹽和重原子存在下，可測10-610-7mol的萘、芘和聯(lián)苯，精密度達(dá)6%,3、重原子效應(yīng) 在含重原子的溶劑（碘乙烷和溴乙烷）中，有利于體系間跨躍，磷光增強(qiáng)。另外，還可用Ag+鹽、Pb2+鹽和Tl+鹽等重原子鹽類。,磷光光度計(jì)由光源，激發(fā)光單色器、液槽、發(fā)射光單色器、檢測器等組成。,二、 磷光分析儀器,1、液槽： 為在低溫下測磷光，液槽 （一個(gè)直徑為1mm左右的石英 管）需放在充有液氮的石英制 的小杜瓦瓶中。常用的溶劑是 按5：5：2比例混合的二乙 醚，異戊烷和乙醇的混合物， 稱EPA混合溶劑。當(dāng)它在液氮 中冷凍后成為透明的玻璃狀物 質(zhì)。,2、磷光鏡 由于發(fā)生磷光的物質(zhì)常伴隨有熒光產(chǎn)生，為了區(qū)別磷光和熒光，在激發(fā)光單色器和液槽之間以及在液槽和發(fā)射光單色器之間各裝一個(gè)斬波片，并由一個(gè)同步電動機(jī)帶動。這兩個(gè)斬波片可調(diào)節(jié)為同相或異相。同相時(shí)，磷光和熒光一起進(jìn)入發(fā)射光單色器，測到的是磷光和熒光的總光強(qiáng)。當(dāng)斬波片調(diào)節(jié)為異相時(shí)，激發(fā)光被遮斷。此時(shí)，由于熒光的壽命短，立即消失，而磷光壽命長，測到的僅為磷光。,利用斬波片，不僅可分別測出磷光和熒光，而且可通過調(diào)節(jié)兩個(gè)斬波片的轉(zhuǎn)速，測出不同壽命的磷光。這種具有時(shí)間分辨功能的裝置，是磷光光度計(jì)的一個(gè)特點(diǎn)。 美國PE公司生產(chǎn)的LS5和LS3型發(fā)光光度計(jì)可用于測定熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光。,三、 分析方法及應(yīng)用 一般與熒光分析法相同，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。 與熒光分析法相似，磷光分析法在有機(jī)、生物、醫(yī)藥及臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域中得到了應(yīng)用。它與熒光法相互補(bǔ)充，成為痕量有機(jī)分析的重要手段。,5-4 化學(xué)發(fā)光分析法,一、概述： 某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，由于吸收了反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，便發(fā)出一定波長的光。這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過程稱為化學(xué)發(fā)光。利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而建立起來的分析方法稱為化學(xué)發(fā)光分析法?；瘜W(xué)發(fā)光也發(fā)生于生命體系，這種發(fā)光稱為生物發(fā)光。,二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理 1、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件：化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)過程產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)所發(fā)射的光。任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都應(yīng)包括化學(xué)激發(fā)和發(fā)光兩個(gè)步驟，必須滿足如下條件： （1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的激發(fā)能，激發(fā)能主要來源于反應(yīng)焓。大多數(shù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)為氧化還原反應(yīng)。 （2）要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程，使化學(xué)反應(yīng)的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)。 對于有機(jī)分子的液相化學(xué)發(fā)光來說，容易生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物的常是芳香族化合物和羰基化合物 （3）激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個(gè)分子，而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子的形式回到基態(tài)。,2、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率cl 又稱化學(xué)發(fā)光的總量子產(chǎn)率。它決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率ce和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率em。 定義為 cl =發(fā)射光子的分子數(shù) / 參加反應(yīng)的分子數(shù) = ceem 化學(xué)反應(yīng)的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由參加反應(yīng)物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)所決定。每個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都有其特征的化學(xué)發(fā)光光譜及不同的化學(xué)發(fā)光效率。,3、化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度Icl 以單位時(shí)間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)表示。它與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的速率有關(guān)，而反應(yīng)速率又與反應(yīng)分子濃度有關(guān)。即 Icl （t）= cl dc/dt 式中 Icl（t）表示t時(shí)刻的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，是與分析物有關(guān)的化學(xué)發(fā)光效率；dc/dt是分析物參加反應(yīng)的速率。 發(fā)光強(qiáng)度Icl與分析物濃度成正比,三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型 1. 直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光 直接發(fā)光是被測物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。 A + B C* + D C* C + h 式中A或B是被測物，通過反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C* ，當(dāng)C* 躍遷回基態(tài)時(shí)，輻射光子。,間接發(fā)光是被測物A或B，通過化學(xué)反應(yīng)生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C* ， C* 不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F，使F躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。 A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h 式中C*為能量給予體，而F為能量接受體,2. 氣相化學(xué)發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光 按反應(yīng)體系的狀態(tài)分類，如化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在氣相中進(jìn)行稱為氣相化學(xué)發(fā)光；在液相或固相中進(jìn)行稱為液相或固相化學(xué)發(fā)光；在兩個(gè)不同相中進(jìn)行則稱為異相化學(xué)發(fā)光。 （1）氣相化學(xué)發(fā)光 主要