DB33T 598-2006 水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法.docVIP

DB33/T 浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2006-02-08實施2006-01-05發(fā)布水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 Determination of residues of malachite green and its metabolite in aquatic productsLC-MS/MS methodDB33/T 5982006DB33浙江省地方標準ICS 67.050B 50 1DB33/T 5982006前 言本標準的附錄A為資料性附錄。本標準由浙江省海洋與漁業(yè)局提出并歸口。本標準起草單位：浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心。本標準主要起草人：張海琪、何中央、鄭重鶯、王揚、宋琍琍。I水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法1 范圍本標準規(guī)定了水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本標準適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠和無色孔雀石綠殘留量的檢測。本標準的檢測限為0.50 g/kg。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3 原理樣品中的孔雀石綠和無色孔雀石綠以乙酸銨鹽溶液和乙腈提取，經(jīng)二氯甲烷萃取，陽離子交換柱凈化，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標法定量。4 試劑和材料除非另有說明，僅使用分析純試劑。4.1 水：應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的一級水。4.2 乙腈：色譜純。4.3 二氯甲烷。4.4 甲醇：色譜純。4.5 無水乙酸銨：優(yōu)級純。4.6 冰乙酸。4.7 鹽酸羥胺。4.8 對甲苯磺酸。4.9 中性氧化鋁：粒度為100目200目，層析用。4.10 甲酸：優(yōu)質(zhì)純。4.11 無水硫酸鈉。4.12 一縮二乙二醇。4.13 抗壞血酸。 4.14 孔雀石綠草酸鹽、無色孔雀石綠、氘代孔雀石綠、氘代無色孔雀石綠標準品：純度98。4.15 乙酸銨溶液：0.05 mol/L(pH4.5)，稱取3.85 g無水乙酸銨（4.5）溶解于1000 mL水中，用冰乙酸（4.6）調(diào)pH到4.5。4.16 鹽酸羥胺溶液：25%（m/v），稱取12.5 g鹽酸羥胺（4.7）溶于50 mL水中。 4.17 對甲苯磺酸溶液：1.0 mol/L，稱取17.2 g對甲苯磺酸（4.8），用水稀釋至100 mL。4.18 抗壞血酸甲醇溶液：1.0 g/L，稱取10 mg抗壞血酸（4.13）溶解于10 mL甲醇溶液中，臨用前配制。4.19 陽離子交換柱：PRS柱，500 mg/3 mL，使用前用5 mL乙腈：二氯甲烷（80+20）活化。4.20 洗脫液：5 mL 25% 氨水，5 mL抗壞血酸甲醇溶液（4.17），90 mL甲醇混合，臨用前配制。4.21 樣品定容液：取80 mL乙腈，15 mL乙酸銨溶液(4.15)和5 mL抗壞血酸甲醇溶液（4.18），臨用前配制。4.22 標準儲備溶液：100 g/mL，準確稱取孔雀石綠草酸鹽、無色孔雀石綠、氘代孔雀石綠、氘代無色孔雀石綠標準品，用乙腈分別配制成100 g/mL的標準貯備液，-18避光保存?zhèn)溆?，有效期為三個月。4.23 混合標準儲備溶液：1 g/mL，吸取孔雀石綠和無色孔雀石綠的標準儲備溶液（4.22），用乙腈稀釋成1 g/mL，-18避光保存，有效期為一個月。4.24 混合內(nèi)標工作溶液：100 ng/mL，用乙腈稀釋內(nèi)標儲備溶液（4.22），配制成每毫升含氘代孔雀石綠和氘代無色孔雀石綠各100 ng的混合內(nèi)標工作溶液，-18避光保存，有效期為一個月。4.25 混合標準工作溶液：根據(jù)需要，臨用時用乙腈稀釋混合標準儲備溶液（4.23）和混合內(nèi)標工作溶液，配制成適當(dāng)濃度的混合標準工作溶液，每毫升混合標準工作溶液含有氘代孔雀石綠和氘代無色孔雀石綠各10 ng。5 儀器 5.1 液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。5.2 均質(zhì)器。5.3 臺式離心機：5 000 r/min。5.4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。5.5 固相萃取裝置。5.6 氮吹儀。6 操作方法6.1.1 提取稱取已均質(zhì)的樣品5 g (精確到0.01g)，置于100 mL具塞離心管中，加入200 L 混合內(nèi)標工作溶液（4.24），然后依次加1.5 mL鹽酸羥胺溶液、2.5 mL對甲苯磺酸溶液和5 mL乙酸銨溶液（4.14），10 000 r/min均質(zhì)30 s，振蕩2 min。然后取另一具塞離心管加入20 mL乙腈，清洗均質(zhì)器刀頭后合并到樣品提取離心管中，再加入10 g中性氧化鋁，渦旋混勻30 s，振蕩15 min后，以4 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至盛有100 mL水和2 mL一縮二乙二醇（4.11）的250 mL分液漏斗中。向離心管的殘渣中加入20 mL乙腈，渦旋混勻30 s，以4 000 r/min離心10 min，上清液合并于同一分液漏斗中。6.1.2 凈化于分液漏斗中加入25 L二氯甲烷，充分振搖，靜置分層，下層溶液收集于100 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min，收集有機層于250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中。再用20 mL二氯甲烷重復(fù)提取一次，合并收集液，在40水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至體積小于1.0 mL。轉(zhuǎn)移至10 mL 刻度離心管中，用2 mL乙腈洗滌旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶二次，合并至刻度離心管中，然后上樣于已活化的陽離子交換柱（4.19），棄濾液。先后用5mL乙腈二氯甲烷混合液（80+20）和5 mL甲醇洗滌，棄去流出液。用10 mL洗脫液（4.20）洗脫，收集于刻度試管中，于40用氮氣吹干。然后用2.0 mL樣品定容液（4.21）溶解殘渣，經(jīng)0.2 m濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。6.2 測定6.2.1 色譜條件a) 色譜柱：C18柱（150 mm2.1 mm5 m）或相當(dāng)者；b) 流動相：A相為：含0.1%甲酸的乙腈溶液，B相為含0.1%甲酸的50mmol/L乙酸銨溶液，A+B=85+15(v/v)；c) 流速：0.25 mL/min；d) 柱溫：35；e) 進樣量：20 L；6.2.2 質(zhì)譜條件a) 離子源：電噴霧ESI離子源；b) 掃描方式：正離子掃描；c) 檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；d) 霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮氣；使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求；e) 噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應(yīng)優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度；f) 監(jiān)測離子對情況表1 孔雀石綠和無色孔雀石綠的離子對名稱定量離子對（m/z）非定量離子對（m/z）孔雀石綠329/313329/208無色孔雀石綠331/315331/239氘代孔雀石綠334/318氘代無色孔雀石綠337/3226.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定6.2.3.1 定性測定在相同試驗條件下，樣品中待測物與同時檢測的標準物質(zhì)具有相同的保留時間，并且非定量離子對與定量離子對色譜峰面積的比值相對偏差小于20%，則可判定為樣品中存在該殘留。6.2.3.2 定量測定按照上述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測定樣品和混合標準工作溶液（6.1.2和4.25），以色譜峰面積按內(nèi)標法定量，以氘代孔雀石綠為內(nèi)標物計算孔雀石綠殘留量，以氘代無色孔雀石綠為內(nèi)標物計算無色孔雀石綠殘留量。在上述條件下，孔雀石綠、無色孔雀石綠以及內(nèi)標物氘代孔雀石綠和氘代無色孔雀石綠標準物質(zhì)的提取離子流圖參見附錄A中圖A.1。6.3 空白試驗除不稱取試樣外，均按上述步驟進行。6.4 結(jié)果計算測定結(jié)果可由計算機按內(nèi)標法自動計算，也可按式（1）計算，計算結(jié)果需扣除空白值。 （1）式中：X 樣品中待測組分殘留量，單位為微克每千克（g/kg）；C 孔雀石綠或無色孔雀石綠標準工作溶液的濃度，單位為微克每升（g/L）；Csi 標準工作溶液中內(nèi)標物的濃度，單位為微克每升（g/L）；C i0 樣液中內(nèi)標物的濃度，單位為微克每升（g/L）；A00 樣液中孔雀石綠或無色孔雀石綠的峰面積；As 孔雀石綠或無色孔雀石綠標準工作溶液的峰面積；Asi 標準工作溶液中內(nèi)標物的峰面積；Ai 樣液中內(nèi)標物的峰面積；V 樣品定容體積，單位為毫升（mL）；W 樣品稱樣量，單位為克（g）。注：報告測定結(jié)果至小數(shù)二位。7 方法檢測限、準確度和精密度7.1 方法檢測限本方法在水產(chǎn)品孔雀石綠和無色孔雀石綠的檢測限均為0.50 g/kg。7.2 準確度本方法在0.50 g/kg4.00 g/kg添加濃度的回