《基因工程制藥》PPT課件.ppt

第二章 基因工程制藥,第一節(jié) 概 述 第二節(jié) 目的基因的獲得 第三節(jié) 基因表達(dá) 第四節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性 第五節(jié) 基因工程菌中試 第六節(jié) 重組工程菌的培養(yǎng) 第七節(jié) 基因工程藥物的分離純化 第八節(jié) 變性蛋白的復(fù)性 第九節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制,第二章 基因工程制藥,一、基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn) 二、基因工程藥物生產(chǎn)的基本過(guò)程 三、國(guó)內(nèi)外基因工程藥物研究進(jìn)展,基因工程技術(shù)誕生：20世紀(jì)70年代 現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展 基因工程： 應(yīng)用DNA重組技術(shù)，按照人們的意愿，在基因水平上改變生物 遺傳性，創(chuàng)造新的生物物種，通過(guò)工程化手段為人類提供有用產(chǎn)品 和服 務(wù)的技術(shù)。,1. 大量生產(chǎn)過(guò)去通過(guò)常規(guī)生化分離提取技術(shù)難以獲得（富集）的 生理活性蛋白和多肽。 2. 提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)。 3. 開發(fā)更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。 4. 通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程對(duì)天然生理活性物質(zhì)進(jìn)行改造，優(yōu) 化天然的生理活性物質(zhì)。 5. 利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源。 6. 降低成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量。,1. 目的基因的獲得 2. 構(gòu)建DNA重組體 上游技術(shù) 3. 構(gòu)建工程菌 4. 工程菌的發(fā)酵 5. 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 6.產(chǎn)品的檢驗(yàn),目前研制的基因工程藥物主要包括: 1. 免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體; 2. 細(xì)胞因子，如各種干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激生長(zhǎng)因子 表皮生長(zhǎng)因子、凝血因子； 3. 激素，如胰島素、生長(zhǎng)激素、心鈉素； 4. 酶類，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、組織型纖維蛋白溶酶激 活劑、超氧化物歧化酶等。,Vitamin A,一、 反轉(zhuǎn)錄法 二、化學(xué)合成法,1mRNA的純化 （1）選擇表達(dá)目的蛋白質(zhì)豐度高的 mRNA的生物材料。 （2）分離總RNA。 （3）分離mRNA（多聚T纖維素）,2cDNA第一鏈的合成（RT-PCR，隨機(jī)引物） 3cDNA第二鏈的合成 4cDNA克隆 5將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞,6cDNA文庫(kù)的鑒定,7目的cDNA克隆的分離和鑒定,優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確性高、人工接頭、改進(jìn)、利用 局限性： 1小分子量的蛋白或多肽 2已知核苷酸順序或氨基酸順序 3費(fèi)用較高,Vitamin B2,基因表達(dá)的成敗，直接影響藥品的質(zhì)量、成本。基因表達(dá)是外 源基因在生物體轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程，是外源基因異源轉(zhuǎn)錄 翻譯利用宿主功能的過(guò)程，也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主細(xì)胞 進(jìn)攻，保護(hù)自身的過(guò)程。,1. 原核細(xì)胞（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等） 2. 真核細(xì)胞（酵母、絲狀真菌、動(dòng)物細(xì)胞等）,1原核細(xì)胞 （1）大腸桿菌 優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清晰，生長(zhǎng)迅速。 缺點(diǎn)：胞內(nèi)表達(dá)，提取困難。 包含體形式，需復(fù)性。 表達(dá)后不存在修飾作用，應(yīng)用受限。 翻譯產(chǎn)物的N末端常多余一個(gè)甲硫氨酸殘基（AUG啟始密碼子 編碼）容易引起免疫反應(yīng)。 大腸桿菌產(chǎn)生內(nèi)毒素給純化帶來(lái)不便。 蛋白酶水解作用破壞產(chǎn)物。,1原核細(xì)胞 （2）枯草芽孢桿菌 優(yōu)點(diǎn)：分泌能力強(qiáng)，產(chǎn)物可直接到培養(yǎng)液中。 缺點(diǎn)：蛋白酶水解活性更強(qiáng)。 （3）鏈霉菌 優(yōu)點(diǎn)：不致病 分泌能力強(qiáng) 具有糖基化能力 缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件要求高、遺傳穩(wěn)定性差,2真核細(xì)胞 （1）酵母：無(wú)毒、倍增時(shí)間短、分泌功能、糖基化作用、使之 成為理想的宿主。 （2）絲狀真菌：肽剪切、糖基化。 （3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞：產(chǎn)品保真性高，生產(chǎn)效率低。,1載體 表達(dá)載體必須具備下列條件： 載體能獨(dú)立復(fù)制 具有多克?。∕CS）位點(diǎn)和標(biāo)記基因 具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子 具有調(diào)節(jié)基因 具有很強(qiáng)的終止子 具有產(chǎn)生帶有SD序列和AUG的mRNA的能力,基因工程藥物研究中常用的表達(dá)載體 （1）PBV220系統(tǒng) PL、PR串聯(lián)啟動(dòng)子，增強(qiáng)啟動(dòng)信號(hào)。 rrnB基因的終止信號(hào)。 PL、PR與rrnB之間有MCS及SD序列。 CITS857抑制子基因（溫控誘導(dǎo)） 質(zhì)粒較?。?66kb），便于插入大的外源基因,PBG-2: 由PBV220衍生,可以表達(dá)與 IgG結(jié)合的融合蛋白，并且是有蛋 白剪切位點(diǎn)，便于表達(dá)后純化及 純化后剪切。,（2）PET系統(tǒng) IPTG誘導(dǎo)（異丙基-硫代-D-半乳糖苷） 多克隆位點(diǎn)上有NdeI或NCOI單一切點(diǎn)，切開后粘性末端為 ATG，便于外源基因插入表達(dá)。 在外源基因的N末端可融合6個(gè)His，便于純化。,2影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素 （1）外源基因的拷貝數(shù) （2）啟動(dòng)子的強(qiáng)弱 （3）SD序列的有效性 （4）SD與ATG的間距 （5）密碼子的組成（偏愛性） （6）產(chǎn)物的穩(wěn)定性 （7）產(chǎn)物對(duì)宿主的影響,3表達(dá)形式 （1）融合蛋白，增強(qiáng)穩(wěn)定性。 （2）非融合表達(dá)。,1載體 YEP類（酵母附加體質(zhì)粒） 由大腸桿菌質(zhì)粒，2m質(zhì)粒和Trp或URA3組成， ARS來(lái)自2m質(zhì)粒。 YRP（酵母復(fù)制型質(zhì)粒） ARS來(lái)自染色體DNA、TrP1、URA3雙標(biāo)及大腸桿菌質(zhì)粒。 YCP（酵母著絲粒型質(zhì)粒） 除具有YRP元件外，還具有著粒成份。,YIP（酵母整合型質(zhì)粒） 含有可與染色體進(jìn)行同源重組的序列 酵母表達(dá)型質(zhì)粒 分泌型表達(dá)質(zhì)粒 帶有控制蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)序列,2影響目的基因在酵母中表達(dá)的因素 （1）外源基因的拷貝數(shù) （2）TATA盒啟動(dòng)子成分 （3）分泌信號(hào)序列 （4）終止序列 （5）翻譯后修飾 （6）對(duì)宿主影響,基因工程菌在傳代過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象， 質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。,1. 質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定性： 指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比列不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。 主要與兩個(gè)因素有關(guān)： （1）含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代的頻率，質(zhì)粒丟失率與 宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件有關(guān)。 （2）含質(zhì)粒菌與不含質(zhì)粒菌比生長(zhǎng)速率的差異的大小。 2. 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性： 指DNA從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。,1. 選擇合適的宿主菌 2. 選擇合適的載體 3. 選擇壓力 4. 分階段控制培養(yǎng) 5. 控制培養(yǎng)條件 6. 固定化,一、工程菌選擇 二、反應(yīng)器（發(fā)酵罐）設(shè)計(jì) 三、發(fā)酵培養(yǎng)基組成 四、工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測(cè)控制,一、基因工程菌的培養(yǎng)方式 二、基因工程菌的培養(yǎng)工藝 三、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備,基因工程產(chǎn)品純化前的性質(zhì)： 目的產(chǎn)物在體系中含量較低 體系中組份復(fù)雜（細(xì)胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基及無(wú)機(jī)鹽等） 目的產(chǎn)物穩(wěn)定性差：對(duì)pH、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、 剪切力、表面活性劑等十分敏感，容易失活、變性。,1. 含目的產(chǎn)物的初始物料的特點(diǎn) 利用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)物，其上游過(guò)程中的各種因素 均對(duì)分離純化技術(shù)和工藝有直接影響。這些因素包括： （1）菌種類型、形式，各種生物學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)物和副產(chǎn)物種類、 產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)所處的位置，表達(dá)方式（胞內(nèi)、胞外、包含體）， 代謝物種類，產(chǎn)物類似物、毒素和能降解產(chǎn)物的酶類等； （2）原材料和培養(yǎng)基的來(lái)源及質(zhì)量是否穩(wěn)定； （3）生產(chǎn)工藝和條件。包括滅菌方法和條件，生產(chǎn)方式(連續(xù)、批 式、半連續(xù))，生產(chǎn)周期，生產(chǎn)能力，工藝控制條件及方式等； （4）初始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性。包括產(chǎn)物濃度、主要雜質(zhì) 種類和濃度、鹽的種類和濃度、溶解度、pH、粘度、流體力學(xué)性 質(zhì)和熱力學(xué)性質(zhì)等。,2. 物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì) 物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì)包括相關(guān)性和非相關(guān)性雜質(zhì)的含量、 化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量、電荷性質(zhì)及數(shù)量、生物學(xué)特性、 穩(wěn)定性(對(duì)熱、pH、鹽、有機(jī)溶劑等)、溶解度、分配系數(shù)、揮發(fā)性 及吸附性能等。,3. 目的產(chǎn)物的特性 目的產(chǎn)物特性主要有產(chǎn)物的化學(xué)、物理和生物學(xué)特性。 包括化學(xué)組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性(對(duì)熱、冷凍、pH、鹽、有機(jī)溶劑和金屬離子等)、疏水性、擴(kuò)散性、擴(kuò)散系數(shù)、分配系數(shù)、吸附性能、生物活性、親和性、配基種類、表面活性等。,4. 產(chǎn)品質(zhì)量要求 產(chǎn)品質(zhì)量要求主要包括產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)，產(chǎn)品用途，對(duì)純度、生 物活性、比活的要求。允許的雜質(zhì)種類和最大允許含量，特殊雜質(zhì) 的種類和最大允許量，以及對(duì)使用的影響，產(chǎn)品劑型、貯存穩(wěn)定性 等。,基因工程藥物的分離純化一般包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初 步純化、高度純化直至得到純品、成品加工等步驟。,分離純化的技術(shù)特點(diǎn)： 條件溫和 選擇性好 收率要高 純化過(guò)程快速,1. 細(xì)胞收集 2. 細(xì)胞破碎,物理破碎法：高壓勻漿法、高速珠磨法、 超聲破碎法、高壓擠壓法,化學(xué)破碎法：滲透沖擊、增溶法、 脂溶法,生物破碎法：酶溶法（溶菌酶、甘露糖酶 、 殼多糖酶等）,超聲破碎法,分離細(xì)胞碎片常用的方法有： 離心沉淀：高速離心、超速離心 膜過(guò)濾：微濾、超濾和反滲透 雙水相萃取：聚乙二醇-葡聚糖 聚乙二醇-無(wú)機(jī)鹽,分離純化主要依賴色譜分離方法。 色譜技術(shù)包括： 離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、 凝膠過(guò)濾色譜、高效液相色譜等。,1. 離子交換層析： 是以離子交換劑為固定相， 依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換 劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí) 的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離 的一種層析方法。 pH、兩性分子、側(cè)鏈、,2. 疏水層析： 是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異，對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離的層析方法。 疏水層析最常用填料是多聚糖（如瓊脂糖）及硅膠。 利用氨基酸側(cè)鏈的疏水鍵。,3. 親和層析： 是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間非常特異的生物親和力進(jìn)行吸附，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。,4. 凝膠過(guò)濾層析： 又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析，是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對(duì)溶液中各組分進(jìn)行分離的液相層析方法。 大分子先從色譜柱中流出,1. DNA的去除 （1）DNA在pH 4. 0以上呈陰離子，可用陰離子交換劑吸附除去， 但目的蛋白質(zhì)PI應(yīng)在6. 0以上。 （2）如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，則可選擇條件使其吸附在陽(yáng)離子交換劑 上，而不讓DNA吸附上去。 （3）利用親和層析吸附蛋白質(zhì)，而DNA不被吸附，也可分離。 （4）疏水層析對(duì)分離也有效，在上柱時(shí)需要高鹽濃度，使DNA-蛋 白質(zhì)結(jié)合物離解，蛋白質(zhì)吸附在柱上，而DNA不被吸附。,2. 熱原質(zhì)的去除 （1）整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程在無(wú)菌條件下進(jìn)行，防止產(chǎn)生熱原質(zhì)。 （2）所有層析介質(zhì)在使用前先除去熱原質(zhì)，在28下進(jìn) 行操作，洗脫液需先經(jīng)無(wú)菌處理，流出的蛋白質(zhì)溶液 也應(yīng)無(wú)菌處理，即通過(guò)0. 2m微濾膜，并在28下保存。,3. 病毒的去除 成品中必須檢查是否含有病毒。病毒主要來(lái)源于宿主細(xì)胞。經(jīng)過(guò)色譜分離， 一般能除去病毒，必要時(shí)可以用紫外線照射使病毒失活，或過(guò)濾將病毒除去。,根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇 根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇 （1）要具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。 （2）要盡可能減少組成工藝的步驟。 （3）組成工藝的各技術(shù)或步驟之間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝與設(shè) 備也能相互適應(yīng)。 （4）在工藝過(guò)程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干 擾產(chǎn)品質(zhì)量。 （5）工藝時(shí)間要盡可能短。 （6）工藝和技術(shù)必須高效，收率高，易操作，對(duì)設(shè)備要求低，能耗低。 （7）具有較高的安全性。,一、包含體形成的原因 二、包含體的分離和溶解 三、包含體蛋白復(fù)性方法,包含體形成的原因主要是高水平表達(dá)的結(jié)果。 在高水平表達(dá)時(shí)，新生肽鏈的聚 集速率一旦超過(guò)蛋白正確折疊的速率就會(huì)導(dǎo)致包含體的形成。 重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，缺乏一些蛋白折疊過(guò)程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，也導(dǎo)致包含體的形成。,電鏡下包含體顆粒,包含體雖然由無(wú)活性的蛋白組成，但包含體形成對(duì)重組蛋白的生產(chǎn)提供了幾個(gè)優(yōu)勢(shì)： 包含體具有高密度，易于分離純化； 重組蛋白以包含體的形式存在有效地抵御了大腸桿菌中的蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解； 用于生產(chǎn)處于天然構(gòu)象對(duì)宿主細(xì)胞有毒害的蛋白。,1.包含體的分離 （1）對(duì)培養(yǎng)收集的重組菌進(jìn)行破碎（高壓勻漿、超聲波破碎等），為了提 高破碎率，可以加入一定量的溶菌酶。 （2）離心除去破碎上清液，沉淀部分用含有低濃度的變性劑（如脲和鹽酸 胍）、去垢劑（如Triton X-100）、脫氧膽酸鈉等化合物的緩沖液進(jìn)行 洗滌，如果需要對(duì)包含體進(jìn)行純化，一般多采用蔗糖密度梯度離心法。,2.包含體的溶解 包含體的溶解一般都用強(qiáng)的變性劑如脲、鹽酸胍或硫氰酸鹽，或去垢劑如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等；對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，還需加入還原劑如巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇及半胱氨酸。溫度一般選擇在30以促進(jìn)溶解。此外，由于金屬離子具有氧化催化作用，還常常需要加入金屬螯合劑如EDTA以除去金屬離子。,有效的、理想的折疊復(fù)性方法應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn)： 活性蛋白質(zhì)的回收率高。 正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)分離。 折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。 折疊復(fù)性方法易于放大。 復(fù)性過(guò)程耗時(shí)較少。,一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般性要點(diǎn) 二、生物材料的質(zhì)量控制 三、培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制 四、純化過(guò)程的質(zhì)量控制 五、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制,產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià) 根據(jù)各個(gè)具體品種的情況，提出各不相同的安全性評(píng)價(jià)要求，這類制品安全性臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)范圍須根據(jù)不同情況作不同規(guī)定。,2. 產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu) 基因工程產(chǎn)品或人的多肽和蛋白質(zhì)相同，或其氨基酸序列或翻 譯后修飾上存在差異，或是非人源性或外源多肽和蛋白質(zhì)，如病毒、 細(xì)菌抗原。對(duì)上述后兩類產(chǎn)品，視其特點(diǎn)作藥動(dòng)學(xué)、毒理學(xué)研究。對(duì) 基因修飾產(chǎn)品，要作一般毒性、長(zhǎng)期毒性以及致突變、致癌變和致畸 變等遺傳毒理研究。,3. 嚴(yán)格控制條件 宿主細(xì)胞中表達(dá)的天然基因，轉(zhuǎn)錄或翻譯后，或精制、工藝放大過(guò) 程中，都有可能發(fā)生變化，故從原料到制成品制備全過(guò)程的每一步都 須嚴(yán)格控制條件與鑒定質(zhì)量，確保符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格、安全有效。,原材料的質(zhì)量控制是要確保編碼藥品的DNA序列的正確性， 重組微生物來(lái)自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的 安全性和一致性，所以原材料的質(zhì)量控制主要是對(duì)目的基因、表達(dá) 載體以及宿主細(xì)胞的檢查。,1.目的基因 根據(jù)指控要求，需明確目的基因的來(lái)源、克隆經(jīng)過(guò)；對(duì)于改造 過(guò)的基因應(yīng)說(shuō)明被修改的密碼子、被切除的肽段及拼接的方法； 使用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的基因，應(yīng)說(shuō)明擴(kuò)增的模板、引物及酶反應(yīng) 條件等情況，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列等分析方法 確證基因結(jié)構(gòu)的正確無(wú)誤。,2. 表達(dá)載體 應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分(如復(fù)制 子、啟動(dòng)子)的來(lái)源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性 標(biāo)記物等。,3.宿主細(xì)胞 應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其 生物學(xué)特性等；需闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主 細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，是否整合到染色體內(nèi)及拷貝數(shù)，并證明宿主細(xì) 胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè) 端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過(guò)程中，啟動(dòng)與控 制克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平。,在貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過(guò)積中，要求質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無(wú)突變；重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。,1.生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù) 需證明種子批不含致癌因子，無(wú)細(xì)菌、病毒、霉菌和支原體等污 染，由原始種子批建生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫(kù)。 在同一實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)內(nèi)，不得同時(shí)操作兩種不同的細(xì)胞或菌種， 一個(gè)工作人員也不得同時(shí)操作兩種不同的細(xì)胞或菌種。 建原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來(lái)源、 方式、保存及預(yù)計(jì)使用期，保存與復(fù)蘇時(shí)宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。 對(duì)生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)品生成的方法和材料，并 控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞 /載體系統(tǒng)穩(wěn)定性確定最高允許傳種代數(shù)。,2.培養(yǎng)過(guò)程 培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)測(cè)定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)胞 長(zhǎng)期培養(yǎng)后的基因型特征； 依宿主細(xì)胞/載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間， 并定期評(píng)價(jià)細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。 培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)的特性。,分離純化過(guò)程中，常用分級(jí)沉淀、超濾、電泳和色譜等技術(shù)，其質(zhì)量控制要求能保證去除微量DNA、糖類、殘余宿主蛋白質(zhì)、純化過(guò)程帶入的有害化學(xué)物質(zhì)及熱原質(zhì)，或者將這類雜質(zhì)都控制在規(guī)定限度以下。,純化工藝的每一步完成后均應(yīng)測(cè)定收獲物純度，計(jì)算提純倍數(shù)、收獲率等，要對(duì)每一步的純化效率、活性回收率和蛋白回收率進(jìn)行檢測(cè)。 要明確使用的純化方法的原理、目的以及預(yù)期的去除雜質(zhì)的效果，在不同純化步驟中能去除不同性質(zhì)的雜質(zhì)，并進(jìn)行相應(yīng)的工藝驗(yàn)證。 純化方法的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮到盡量去除污染病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白、糖以及純化過(guò)程帶入的其他有害物質(zhì)。 純化工藝過(guò)程中應(yīng)盡量不加入對(duì)人體有害的物質(zhì)。,如用柱層析技術(shù)應(yīng)提供所用填料的質(zhì)量認(rèn)證證明，并證實(shí)從柱上 不會(huì)掉下有害物質(zhì)。 上樣前應(yīng)清洗除去熱原質(zhì)等。 若用親和層析技術(shù)，不應(yīng)含有可測(cè)出的異種免疫球蛋白。 如在反相純化步驟中用到乙腈或甲醇等有機(jī)溶劑，用Protein A親 和層析純化抗體，有機(jī)溶劑和Protein A等這些對(duì)人體有害的物質(zhì)應(yīng)加 以去除和控制。,基因工程藥物質(zhì)量控制主要包括以下幾項(xiàng)要求： 產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。 需要綜合利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué) 和分子生物學(xué)等多門學(xué)科的理論與技術(shù)，保證基因工程藥品的 安全有效。,1生物活性測(cè)定 多肽和蛋白質(zhì)藥物的生物學(xué)活性是蛋白質(zhì)藥物的重要質(zhì)量控制指標(biāo)。 效價(jià)測(cè)定必須采用國(guó)際上通用的方法，測(cè)定結(jié)果必須用國(guó)際或國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn)品進(jìn)行校正，以國(guó)際單位表示或折算成國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)單位。 生物學(xué)效價(jià)的測(cè)定往往需要進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)或通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行體 外效價(jià)測(cè)定。 體內(nèi)生物活性的測(cè)定要根據(jù)目的產(chǎn)物的生物學(xué)特性建立適合的生物學(xué) 模型。 體外生物活性測(cè)定的方法有細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)法、3H-TdR摻入法和酶法 細(xì)胞計(jì)數(shù)等。,蛋白質(zhì)的比活性是每毫克蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。它不僅是含量指標(biāo)，也是純度指標(biāo)。 由于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)不能常規(guī)測(cè)定，而蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，特別是二硫鍵的錯(cuò)配，可影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，從而影響蛋白質(zhì)藥物的藥效，比活性可以間接地反應(yīng)這一情況。,2理化性質(zhì)鑒別 （1）非特異性鑒別 根據(jù)還原型電泳的遷移率和高效液相色譜的保留時(shí)間和峰型來(lái) 進(jìn)行分析。 （2）特異性鑒別 利用免疫印跡、免疫電泳、免疫擴(kuò)散等免疫學(xué)方法，確定蛋白 質(zhì)的抗原性。,（3）相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定最常用的方法有凝膠過(guò)濾法和 SDS-PAGE法，凝膠過(guò)濾法測(cè)定完整的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量， 而SDS-PAGE法測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。 （4）等電點(diǎn)測(cè)定 樣品用等點(diǎn)聚焦法測(cè)定等電點(diǎn)。在生產(chǎn)過(guò)程中，批與批之 間的電泳結(jié)果應(yīng)該一致，以此控制生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。,（5）肽圖分析 肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì)，對(duì)生成的肽段進(jìn) 行分離分析。是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中細(xì)微變化的最有效方法。 肽圖分析可作為制品與標(biāo)準(zhǔn)品作精密比較的手段，與氨基酸成 分和序列分析結(jié)果合并，作為蛋白質(zhì)的精確鑒別。 該技術(shù)靈敏高效，是對(duì)基因工程藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性 進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證的首選方法。 同種產(chǎn)品不同批次的肽圖的一致性是工藝穩(wěn)定性的驗(yàn)證指標(biāo)。,蛋白質(zhì)降解形成的肽段的鑒定可以用SDS-PAGE電泳法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）、毛細(xì)管電泳法及質(zhì)譜法來(lái)測(cè)定。,（6）氨基酸組成分析 一般對(duì)含50個(gè)左右的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的定量分析接近 理論值。 完整的氨基酸成分分析結(jié)果，應(yīng)包括甲硫氨酸、胱氨酸和 色氨酸的準(zhǔn)確值。 氨基酸成分分析結(jié)果應(yīng)為三次分別水解樣品測(cè)定后的平均 值。測(cè)定的重組蛋白質(zhì)的氨基酸組成應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品一致。 氨基酸組成分析采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定，包括蛋白質(zhì) 水解、自動(dòng)進(jìn)樣，氨基酸分析、定量分析報(bào)告等內(nèi)容。,（7）部分氨基酸序列分析 此項(xiàng)是重組蛋白質(zhì)的重要鑒別指標(biāo)，一般要求對(duì)中試前 三 批產(chǎn)品至少應(yīng)該測(cè)定N端15個(gè)氨基酸，C端應(yīng)根據(jù)情況測(cè)定 13個(gè)氨基酸。 （8）蛋白質(zhì)二硫鍵分析 測(cè)定巰基的方法有別PMCB法、DTNB法、NEMI法等。,3.蛋白質(zhì)含量測(cè)定 主要用于原液比活性計(jì)算和成品規(guī)格的控制。 蛋白質(zhì)含量可根據(jù)其物化性質(zhì)采用Folin-酚試劑法、染色 法（Bradford）、雙縮脲法、紫外吸收法，HPLC法和凱氏定 氮法等方法，其中Folin-酚試劑法、染色法是在質(zhì)量檢定中常 使用的方法。,4.蛋白質(zhì)純度分析 純度分析是基因工程藥物質(zhì)量控制的關(guān)鍵項(xiàng)目。測(cè)定蛋白 質(zhì)含量可根據(jù)其本身理化性質(zhì)和生物學(xué)特性設(shè)計(jì)。通常采用的 方法有還原性及非還原性SDS-PAGE、等電點(diǎn)聚焦、各種 HPLC及毛細(xì)管電泳等。,5.雜質(zhì)的檢測(cè) 基因工程產(chǎn)物的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩類。,（1）蛋白類雜質(zhì) 在蛋白類雜質(zhì)中，最主要的是純化過(guò)程中殘余的宿主細(xì)胞蛋白。 測(cè)定采用免疫分析的方法。同時(shí)需輔以電泳等其他檢測(cè)手段補(bǔ)充和驗(yàn) 證。 除宿主細(xì)胞蛋白外，目的蛋白本身也可能發(fā)生某些變化，形成在 理化性質(zhì)上與原蛋白質(zhì)極為相似的蛋白雜質(zhì)，在體內(nèi)往往會(huì)導(dǎo)致抗體 的產(chǎn)生，在質(zhì)量控制中也要加以嚴(yán)格控制。,（2）非蛋白類雜質(zhì) 具有生物學(xué)作用的非蛋白類雜質(zhì)主要有病毒和細(xì)菌等微生物、熱 原質(zhì)、內(nèi)毒素、致敏原及DNA。基因工程藥物應(yīng)證實(shí)最終制品中無(wú)外 源病毒和細(xì)菌等污染。 熱原質(zhì)可用傳統(tǒng)的注射家兔法進(jìn)行檢測(cè)。 目前鱟試驗(yàn)法測(cè)定內(nèi)毒素。 必須用敏感的方法來(lái)測(cè)定來(lái)源于宿主細(xì)胞的殘余DNA的含量。,6.穩(wěn)定性考察 藥品的穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)藥品有效性和安全性的重要指