平邑甜茶論文：平邑甜茶MhWRKY15基因的克隆及表達分析

平邑甜茶論文：平邑甜茶MhWRKY15基因的克隆及表達分析【中文摘要】轉錄因子是結合在基因特定DNA序列上的蛋白質,它通過增強或抑制基因的轉錄效率來調控基因的表達水平,真核生物的基因表達調控主要是在轉錄水平進行。WRKY轉錄因子作為一種重要的誘導型調節(jié)因子,參與植物的多種防衛(wèi)反應、生長發(fā)育調節(jié)以及物質代謝調節(jié)等各種重要生理活動。平邑甜茶(Malus hupehensis (Pamp) Rehd. var pinyiensis Jiang)是我國特有的植物資源,常用作蘋果和觀賞海棠的砧木。本研究以平邑甜茶為試材,克隆了MhWRKY15基因的全長cDNA序列,并運用生物信息學手段分析了其基因序列與編碼蛋白的性質和功能;同時,研究了其在生長過程及逆境脅迫下的表達情況,并成功構建RNAi載體并轉化擬南芥,獲得轉基因擬南芥植株。主要結果如下:1).獲得了平邑甜茶MhWRKY15基因,該基因cDNA全長1091bp,含有810bp的完整開放閱讀框,編碼269個氨基酸,屬于WRKY類轉錄因子的第II組,為WRKY15家族成員。GenBank登錄號為GU576874。2).生物信息學分析表明, MhWRKY15編碼蛋白為可溶性蛋白,其分子式為C_(1263)H_(1.【英文摘要】Transcription factors were proteins that binding with specific DNA sequences of target gene, which could regulate gene expression by enhancing or inhibiting the efficiency of gene transcription. Regulation of the gene expression in eukaryotic was mainly at the transcriptional level. WRKY transcription factor was an important inducible regulatory factor which participated in a variety of important physiological activities, such as plant defense responses, growth regulation and metabolism regulation.Malus.【關鍵詞】平邑甜茶 WRKY15基因分離 RNAi 擬南芥轉化 半定量RT-PCR【英文關鍵詞】Malus hupehensis (Pamp) Rehd. WRKY15 gene isolation RNAi Transformation of Arabidopsis thaliana semi RT-PCR【目錄】平邑甜茶MhWRKY15基因的克隆及表達分析英文縮寫符號及其中英文對照表4-9中文摘要9-10Abstract10-111前言12-231.1 WRKY 的結構特征及其分類12-131.2 WRKY 轉錄因子的結構域13-141.3 WRKY 轉錄因子的表達及其生物學功能14-201.3.1 WRKY 轉錄因子的表達特性14-151.3.2 WRKY 轉錄因子在植物防衛(wèi)反應中的作用15-171.3.3 WRKY 轉錄因子在植物形態(tài)建成中的作用171.3.4 WRKY 轉錄因子在植物代謝中的作用17-181.3.5 WRKY 與MAPK 相互作用關系18-201.4 果樹轉錄因子研究進展20-221.5 本研究目的和意義22-232 材料與方法23-372.1 試驗材料23-242.1.1 試材232.1.2 菌株與質粒232.1.3 酶及生化試劑232.1.4 PCR 引物23-242.2 試驗方法24-372.2.1 平邑甜茶總RNA 的提取24-252.2.2 RT-PCR 反轉錄合成cDNA25-262.2.3 MhWRKY15 全長序列的擴增26-312.2.3.1 巢式PCR 擴增MhWRKY15 中間片段26-272.2.3.2 3-RACE 擴增3端序列272.2.3.3 5-RACE 獲得5端序列27-312.2.4 DNA 片段與克隆載體的連接312.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化31-322.2.5.1 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備312.2.5.2 大腸桿菌感受態(tài)細胞的轉化31-322.2.6 堿法小量質粒DNA 的提取322.2.7 凝膠電泳中DNA 片段的回收32-332.2.8 質粒DNA 的酶切鑒定332.2.9 DNA 序列測定332.2.10 pFGC5941-RNAi-MhWRKY15 表達載體的構建33-342.2.11 擬南芥轉化及轉化植株的PCR 鑒定34-352.2.12 pCAMBIA1390-MhWRKY15-GFP 表達載體的構建352.2.13 根癌農桿菌GV3101 和EHA105 感受態(tài)細胞的制備與轉化35-362.2.13.1 根癌農桿菌感受態(tài)細胞制備35-362.2.13.2 凍融法轉化農桿菌362.2.14 半定量RT-PCR 分析362.2.15 生物信息學分析36-373 結果與分析37-513.1 平邑甜茶MhWRKY15 基因克隆與序列分析37-443.1.1 MhWRKY15 基因的分離37-383.1.1.1 MhWRKY15 中間片段的分離373.1.1.2 MhWRKY 15 3片段的分離373.1.1.3 MhWRKY 15 5片段的分離373.1.1.4 MhWRKY15 全長cDNA 的分離37-383.1.2 平邑甜茶MhWRKY15 基因的序列分析38-393.1.3 平邑甜茶MhWRKY15 編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析39-413.1.3.1 蛋白保守域分析393.1.3.2 系統(tǒng)進化樹分析393.1.3.3 部分植物WRKY 蛋白序列多重比對39-413.1.4 平邑甜茶MhWRKY15 編碼蛋白的性質及結構分析41-443.1.4.1 理化性質分析413.1.4.2 跨膜區(qū)域分析41-423.1.4.3 信號肽分析423.1.4.4 疏水性分析42-433.1.4.5 修飾位點分析433.1.4.6 二級結構及三級結構預測43-443.2 平邑甜茶MhWRKY15 蛋白的亞細胞定位44-463.2.1 pCAMBIA1390-MhWRKY15-GFP 表達載體的構建及亞細胞定位443.2.2 MhWRKY15 蛋白亞細胞定位的生物信息學預測44-463.3 平邑甜茶MhWRKY15 RNA 干擾載體的構建及擬南芥轉化46-493.3.1 目的片段的克隆及重組子鑒定463.3.2 RNA 干擾載體的鑒定46-493.4 平邑甜茶MhWRKY15 基因的表達分析49-513.4.1 平邑甜茶根系中MhWRKY15 基因在不同脅迫下的表達分析49-503.4.2 平邑甜茶MhWRKY15 基因在不同發(fā)育期的表