實(shí)驗(yàn)2氨基酸薄層層析.pptVIP

如何分離鑒定氨基酸混合液？ 陳 健,生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,氨基酸的薄層層析 (Thin layer chromatography of amino acids),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握薄層層析法的一般原理。 掌握氨基酸薄層層析法的基本操作技術(shù)。 掌握如何根據(jù)移動(dòng)速率（Rf值）來(lái)鑒定 被分離的物質(zhì)（即氨基酸混合液）。,層析基本概念,層析技術(shù)是利用化合物中各組分的物理性質(zhì)（如溶解度、吸附能力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分不同程度地分布在兩相中，隨著流動(dòng)相從固定相上流過(guò)，不同組分以不同速度而最終被分離。 特點(diǎn)：分離效率高，能分離各種性質(zhì)相類(lèi)似的物質(zhì)。不僅可用于少量物質(zhì)的分離純化，也可用于大量物質(zhì)的分離純化和制備。,層析基本概念,固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。包括固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等）和液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用。 流動(dòng)相：在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)移動(dòng)的液體、氣體等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。,層析技術(shù)的分類(lèi),（1）按兩相所處狀態(tài)，可分為液相層析和氣相層析，前者以液體為流動(dòng)相，后者以氣體為流動(dòng)相。 （2）按操作形式不同，可分為柱層析、薄層層析和紙層析。 （3）按層析的原理不同，可分為吸附層析、分配層析、凝膠層析、離子交換層析和親和層析等。,今天要做的試驗(yàn)，根據(jù)原理屬于吸附層析，根據(jù)操作形式又屬于薄 層層析，合到一起叫：吸附薄層層析。,試驗(yàn)過(guò)程,2cm,1cm,1、位置：用鉛筆距底邊2cm水平線上均勻確定4個(gè)點(diǎn)。每個(gè)樣品間相距約1cm。 2、取樣：用毛細(xì)管分別吸取氨基酸溶液，取樣量為毛細(xì)管柱高5cm。 3、點(diǎn)樣：點(diǎn)樣毛細(xì)管輕輕接觸薄層表面點(diǎn)樣。加樣后原點(diǎn)擴(kuò)散直徑不超過(guò)2mm。,Ala Arg Gly Mix,輕觸疾起,操作步驟點(diǎn)樣,操作步驟 展層、顯色,Ala Arg Gly Mix,將薄層板點(diǎn)樣端浸入展層-顯色劑，展層-顯色劑液面應(yīng)低于點(diǎn)樣線。蓋好層析缸蓋，上行展層。當(dāng)展層劑前沿離薄板頂端2cm時(shí)，停止展層，取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線，用熱風(fēng)吹干或在85下烘干，即可顯出各層斑點(diǎn)。,試樣展開(kāi)過(guò)程,實(shí)驗(yàn)原理,1.薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一種 一般是將固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當(dāng)液相（展開(kāi)溶劑）在固定相上流動(dòng)時(shí)，由于吸附劑對(duì)不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開(kāi)溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開(kāi)劑的移動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開(kāi)。（即通過(guò)吸附-解吸-再吸附-再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分離開(kāi)來(lái)）,硅膠吸附薄層層析,實(shí)驗(yàn)原理,吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠 硅膠：表達(dá)式為SiO2XH2O。層析用硅膠是一種多孔性物質(zhì)，它的硅氧環(huán)交鏈結(jié)構(gòu)表面上密布極性硅醇基（SiOH），這種極性的硅醇基能和許多化合物形成氫鍵而產(chǎn)生吸附.,實(shí)驗(yàn)原理,硅膠吸附薄層層析的特點(diǎn)：, 硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負(fù)性相關(guān)。 硅醇基顯較弱的酸性，因而，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用它分離。 硅膠的活化溫度通常為105110，不能過(guò)高。,實(shí)驗(yàn)原理,2. 氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng) 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它與氨基酸的羧基反應(yīng)生成還原茚三酮、氨及醛，與此同時(shí)，還原茚三酮又與氨及茚三酮縮合生成紫紅化合物而使氨基酸斑點(diǎn)顯色。,實(shí)驗(yàn)原理,3.混合氨基酸被分離后在薄層層析圖譜上的位置用相對(duì)遷移率Rf值（rate of flow）來(lái)表示。 層析中，物質(zhì)沿溶劑運(yùn)動(dòng)方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比為Rf值。 由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故移動(dòng)速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)。,實(shí)驗(yàn)材料,吸附劑：硅膠 粘合劑： 0.5%的羧甲基纖維素鈉 氨基酸的異丙醇溶液 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 展開(kāi)-顯色劑（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） 分析樣品：氨基酸混合液,器 材,層析板、尺子、鉛筆 燒杯、玻棒、量筒 吹風(fēng)機(jī) 毛細(xì)管、層析缸 藥匙 烘箱,操作步驟薄層板的制備,1、調(diào)漿 稱取硅膠3克，加0.5%的羧甲基纖維素鈉8毫升，調(diào)成均勻的糊狀。 2、涂布 取潔凈的干燥玻璃板均勻涂層。 3、干燥 將玻璃板水平放置，室溫下自然涼干。 4、活化 70烘干30分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至不燙手時(shí)取出。,結(jié)果計(jì)算,Rf =,斑點(diǎn)至原點(diǎn)距離,溶劑前緣至原點(diǎn)距離,小心量出斑點(diǎn)中心至原點(diǎn)中心距離，再量出原點(diǎn)中心至溶劑前沿的距離，計(jì)算出它們的 值。 根據(jù)值，鑒定出混合樣品中氨基酸的種類(lèi)，并繪出層析圖譜。,Rf值測(cè)量,數(shù)據(jù)記錄及結(jié)果,層析圖譜結(jié)果 數(shù)據(jù)及結(jié)果處理參見(jiàn)：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)P127-表9-30，表9-31,復(fù)習(xí)思考題,硅膠的吸附力與含水量的問(wèn)題 吸附實(shí)驗(yàn)中吸附劑的選擇根據(jù) 氨基酸紙層