重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子工程菌高密度發(fā)酵

High Cell Density Fermentation of Recombinant Human B Lymphocyte StimulatorXue Xiao-Chang, Bao Chun-Jie, Han Wei, Qin Xin, Zhang Cun, Cao Zhu-Rong, Li Wei-Na, Zhao Yu-Hong, Zhang YingqiBiotechnology Center of Fourth Military Medical University , Xian 710032Abstract: In order to reach the goal of high cell density fermentation and high level expression of recombinant human B lymphocyte stimulator (E. coli DH5a/ pKKH-BLyS). Pilot test of tube culture and flask shaking culture were done to get optimized culture conditions, including pH value for culture, inducer concentration of IPTG, induction time and duration, range of dissolved oxygen and the manner of feeding. Then, we performed a three-time repeated fermentation under the established conditions. The final cell density was about 25 A600 and more than 50 g of wet bacteria per liter could be obtained. The average expression level of recombinant protein was about 40% of total bacterial proteins. The results show that the established fermentation procedure is stable, of short cycle and with high expression, which lays the basis for further purification and large-scale production of BLyS.Key Words: B Lymphocyte Stimulator, Recombinant Escherichia coli, High cell density fermentation 重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子工程菌高密度發(fā)酵薛曉暢 包春杰 韓葦 秦鑫 張存 曹筑榮 李維娜 趙玉紅 張英起(第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生物技術(shù)中心, 西安710032)摘要：為實(shí)現(xiàn)重組人B淋巴細(xì)胞刺激因子工程菌E.coli DH5a/pKKH-BLyS的高密度、高表達(dá)發(fā)酵, 首先進(jìn)行了培養(yǎng)條件的摸索, 確定了該工程菌的最佳培養(yǎng)pH值、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度、誘導(dǎo)的最佳時(shí)間段、溶氧范圍以及補(bǔ)料的流加方式等, 根據(jù)優(yōu)化條件，用5 L自控發(fā)酵罐進(jìn)行三批重復(fù)發(fā)酵, 最終菌體密度均達(dá)到25 A600以上，菌體獲得量均可達(dá)濕重30 g以上，目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量占菌體總蛋白的40%左右，保持并超過了該重組蛋白在試管和搖瓶中的表達(dá)量。此發(fā)酵工藝具有周期短、產(chǎn)量高、重復(fù)性穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，為下游的純化和進(jìn)一步的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：B淋巴細(xì)胞刺激因子; 重組大腸桿菌; 高密度發(fā)酵中圖分類號(hào): Q516; TQ92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào)：B淋巴細(xì)胞刺激因子（B Lymphocyte Stimulator, BLyS）是1999年由瑞士和美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor, TNF）家族的一個(gè)新成員1。該分子含有285個(gè)氨基酸，屬于II型跨膜蛋白。BLyS主要由T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等髓系來源的細(xì)胞分泌。BLyS以膜結(jié)合及可溶性兩種方式存在于機(jī)體中，兩者均具有生物學(xué)活性。研究表明BLyS在B細(xì)胞的存活和功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用，它可以延長(zhǎng)B細(xì)胞存活時(shí)間、促進(jìn)其增殖，從而導(dǎo)致B細(xì)胞增生和自身免疫狼瘡樣變化的出現(xiàn)。BLyS的過度表達(dá)是發(fā)生自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的重要因素之一2-4。BLyS已經(jīng)成為治療自身免疫性疾病的有效靶點(diǎn)，我們構(gòu)建了人BLyS疫苗表達(dá)重組載體，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明該重組疫苗對(duì)于多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型均具有良好的保護(hù)作用5。但研究結(jié)果僅局限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。欲真正實(shí)現(xiàn)其價(jià)值，必須借助于高密度發(fā)酵技術(shù)，將生產(chǎn)提高到工業(yè)生產(chǎn)的規(guī)模。本文對(duì)重組人BLyS工程菌E. coliDH5a/pKKH-BLyS表達(dá)和生長(zhǎng)的特有規(guī)律進(jìn)行了初步研究，并建立了一個(gè)適用于工業(yè)化的高密度、高表達(dá)生產(chǎn)工藝。1 材料和方法1. 1 材料1. 1. 1 宿主菌和質(zhì)粒宿主大腸桿菌E. coliDH5a supE44 lacU169 (80 lacZM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 購(gòu)自Invitrogen公司；原核非融合表達(dá)載體pKKH由浙江大學(xué)王憲鋒博士贈(zèng)送，重組質(zhì)粒pKKH-BLyS由第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心構(gòu)建，基因的表達(dá)受Trc啟動(dòng)子控制，IPTG能誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，氨芐青霉素抗性。1. 1. 2 培養(yǎng)基LB 培養(yǎng)基用于試管種子培養(yǎng)，2YT培養(yǎng)基用于三角搖瓶培養(yǎng)，半合成培養(yǎng)基用于5 L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料培養(yǎng)。LB 培養(yǎng)基中含有(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；半合成培養(yǎng)基中含有(g/L)：磷酸鹽適量( KH2PO4K2HPO4Na2HPO412H2O =247), (NH4) 2SO4 1.8，NH4Cl 0.3，蛋白胨4.5，酵母粉2.25，甘油適量和微量元素(MgSO4 7H2O 0.3)；補(bǔ)料基質(zhì)中含有(g/L)：甘油適量，酵母粉5，蛋白胨10，MgSO47H2O 0.6。用5 mol/ L NaOH 溶液，將溶液的pH值全部調(diào)為7.0。培養(yǎng)基和補(bǔ)料在121高壓滅菌20 min，各種培養(yǎng)基中都加入氨芐青霉素。1. 1. 3 儀器Biostat-CT5型5L自動(dòng)發(fā)酵罐，德國(guó)B Brown公司；J2-SH型冷凍高速離心機(jī)為美國(guó)Bechman公司產(chǎn)品；微量蛋白電泳儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；Ultrascan XL灰度掃描儀為L(zhǎng)KB產(chǎn)品。1. 2 方法1. 2. 1 試管表達(dá)取-70保存甘油菌種，劃線接種于含氨芐(100 g/ml)的LB平板，37培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落于5 ml LB試管中，37，200 r/min振搖培養(yǎng)至A6000.60.8，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)量最高的克隆作為發(fā)酵用種子，分裝冷凍保存，每批發(fā)酵取出一管，以保證菌種的穩(wěn)定性。未誘導(dǎo)菌液可作為活化種子保存于4。1.2. 2 搖瓶培養(yǎng)2%活化種子接種于含150 ml 2YT的500 ml搖瓶中，37，200 r/min振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，加入IPTG誘導(dǎo)或作為5 L發(fā)酵罐的菌種。1. 2. 3 5L自控發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料培養(yǎng)取三角瓶種子液按3%接種入發(fā)酵罐。控制參數(shù)為溶氧及轉(zhuǎn)速：溶氧控制在30%50%，達(dá)到最大轉(zhuǎn)速800 r/min后, 自動(dòng)通入純氧。溫度控制為37。pH值設(shè)定為7.0，當(dāng)pH低于該值時(shí)，通過流加30%的氨水來保持恒定。補(bǔ)料流加方案為發(fā)酵過程中06 h不加補(bǔ)料，68 h補(bǔ)料流速設(shè)定為50 ml/ h, 810 h補(bǔ)料流速設(shè)定為100 ml/h 。1. 2. 4 重組BLyS表達(dá)量測(cè)定按常規(guī)SDS-PAGE檢測(cè)，灰度掃描儀分析重組蛋白占菌體總蛋白的百分含量。1. 2. 5 菌體濃度測(cè)量采用稱重法和濃度法，A600 nm吸收值與細(xì)胞干重呈線性。一個(gè)單位的A600約為干菌0. 4 g/L。1. 2. 6 菌體總蛋白測(cè)定Bradford法測(cè)菌體總蛋白，總平均值為0. 525 g/g (蛋白/干菌體) 6。2 結(jié)果2. 1 試管培養(yǎng)及條件優(yōu)化2. 1. 1 試管培養(yǎng)中誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化試管培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(A600 =0.6), 加入0.1 mmol/ L IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，每0.5 h取樣一次，SDS-PAGE分析表達(dá)情況。結(jié)果表明誘導(dǎo)1 h后外源蛋白即開始表達(dá)，表達(dá)水平在3 h內(nèi)迅速提高，4 h達(dá)到高峰，5 h后開始下降，菌體密度也有所降低。由此確定發(fā)酵結(jié)束時(shí)間可以在誘導(dǎo)后45 h，控制在菌體密度開始下降前。 1 2 3 4 5 6Fig.1 工程菌發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)曲線和目的蛋白表達(dá)水平。1: 未誘導(dǎo)菌體總蛋白; 2: 誘導(dǎo)1小時(shí)菌體總蛋白; 3: 誘導(dǎo)2小時(shí)菌體總蛋白; 4: 誘導(dǎo)3小時(shí)菌體總蛋白; 5: 誘導(dǎo)4小時(shí)菌體總蛋白; 6: 誘導(dǎo)5小時(shí)菌體總蛋白.2. 1. 2 IPTG濃度對(duì)重組蛋白表達(dá)水平的影響試管培養(yǎng)至A600 =0.6時(shí)，加入IPTG至0. 01、0. 02、0. 05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mmol/L終濃度，誘導(dǎo)表達(dá)4 h，最終菌體密度為1.5 A600，取樣用SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果可見0.01 mmol/L IPTG即有誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)的能力，在0.012 mmol/L時(shí)，IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性影響。本文發(fā)酵中采用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)菌體濃度為25 A600左右的菌體表達(dá)，取得了良好的結(jié)果。1 2 3 4 5 6 7 8 9Fig.2 不同濃度IPTG誘導(dǎo)劑對(duì)于TT-BLyS蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響 1: 未誘導(dǎo)菌體總蛋白; 2-9: 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后菌體總蛋白.2. 2 三角瓶培養(yǎng)中誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響利用特制的通氣良好的三角瓶進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)早、中、晚期(分別培養(yǎng)4 h、6 h、8 h)加入0.1 mmol/ L IPTG進(jìn)行表達(dá)4 h，結(jié)果表明在中期誘導(dǎo)不僅最終菌體密度較高，重組蛋白的產(chǎn)量也較其它各期更高。如在早期誘導(dǎo)，雖然表達(dá)量比較高，但是由于誘導(dǎo)劑的抑制效果收菌量明顯下降；在晚期進(jìn)行誘導(dǎo)，盡管誘導(dǎo)時(shí)菌體密度更高，但誘導(dǎo)后細(xì)菌生長(zhǎng)很快進(jìn)入衰亡期，并有自溶傾向，因而表達(dá)外源基因的能力也隨之下降。2. 3 5L發(fā)酵罐中工程菌的高密度、高表達(dá)培養(yǎng)圖3顯示DH5a/pKKH-BLyS高密度高表達(dá)培養(yǎng)發(fā)酵的在線控制圖。整個(gè)發(fā)酵過程中pH控制在7.0左右，溫度37，溶解氧35%左右，轉(zhuǎn)速于8 h左右達(dá)到800 r/min并開始利用純氧。發(fā)酵開始的06 h，培養(yǎng)基中含有一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，故不加補(bǔ)料，6 h后pH逐漸升高，說明培養(yǎng)基中碳源已耗盡，細(xì)菌生長(zhǎng)分解氮源，結(jié)果代謝產(chǎn)生NH4+而使pH升高，此時(shí)是補(bǔ)料的最佳時(shí)期，同時(shí)加入0.5 mmol/ L IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)BLyS后細(xì)菌的生長(zhǎng)開始逐漸減緩，于誘導(dǎo)后4 h終止發(fā)酵(圖3)，最終菌體密度為25 A600， SDS-PAGE(圖4)后激光灰度掃描得重組蛋白的表達(dá)量約為40%（最高可以達(dá)到47%）。Fig.3pKKH-TT-BLyS/DH5a工程菌補(bǔ)料分批培養(yǎng)的菌體生長(zhǎng)曲線和TT-BLyS表達(dá)曲線 1 2 3 4 5 6 7 A BFig.4 TT-BLyS表達(dá)水平的SDS-PAGE及灰度掃描鑒定A：1: 蛋白質(zhì)分子量Marker; 2,4,6: 未誘導(dǎo)菌體總蛋白; 3,5,7: 誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)情況.B: 目的蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析的灰度掃描結(jié)果.3 討論基因工程菌的發(fā)酵不同于傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，前者帶有外源克隆基因的重組表達(dá)載體，發(fā)酵生產(chǎn)的目的是要獲得大量的外源基因產(chǎn)物，盡可能減少宿主細(xì)胞本身蛋白的污染。重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)受表達(dá)系統(tǒng)、培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式、發(fā)酵條件控制等多種因素的影響7,8，對(duì)菌體高密度培養(yǎng)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)高表達(dá)的研究報(bào)道不多。在實(shí)際操作中，需要對(duì)各種因素進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳的發(fā)酵工藝。在本研究中，我們對(duì)單因素逐個(gè)優(yōu)化，最終達(dá)到對(duì)整個(gè)工藝的優(yōu)化。我們采用建立的中試發(fā)酵工藝，三批重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，最終菌體密度均超過A 600 nm25，菌體獲得量均達(dá)濕質(zhì)量濃度50 g/L 以上，目的蛋白表達(dá)量均高于40%，比試管和搖瓶的表達(dá)水平略有提高，取得了較佳的結(jié)果。試管和搖瓶培養(yǎng)條件的摸索對(duì)發(fā)酵的成功很關(guān)鍵，其中,碳源的選擇至關(guān)重要，對(duì)于大腸桿菌，高濃度的葡萄糖將造成乙酸鹽的堆積，降低工程菌產(chǎn)量和表達(dá)量。因此,選用甘油作為碳源較好。由于各種工程菌都有其自身的生長(zhǎng)和表達(dá)規(guī)律，發(fā)酵的另一個(gè)重要因素就是外源蛋白最佳的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。誘導(dǎo)后，攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞生長(zhǎng)速率顯著降低，而不帶質(zhì)粒的細(xì)胞則不受影響。因此，提前誘導(dǎo)使菌體和目的蛋白的產(chǎn)量降低，同時(shí)也增加了染菌的機(jī)會(huì)。而誘導(dǎo)較晚雖可以獲產(chǎn)量高的菌體量，但細(xì)菌已經(jīng)開始老化，其生長(zhǎng)和表達(dá)外源蛋白的能力會(huì)下降，同時(shí)表達(dá)外源蛋白消耗的大量能量會(huì)促使細(xì)菌的生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，很容易導(dǎo)致溶菌。本文通過對(duì)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的優(yōu)化，使得整個(gè)發(fā)酵過程在10 h內(nèi)完成，既實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的高表達(dá)、高產(chǎn)率，同時(shí)也降低了成本。補(bǔ)料的流加方式直接影響著發(fā)酵的效果。分批補(bǔ)料培養(yǎng)的特點(diǎn)是，在培養(yǎng)過程中不斷補(bǔ)充培養(yǎng)基，使菌體在較長(zhǎng)時(shí)間里保持穩(wěn)定的生長(zhǎng)速率，從而達(dá)到高密度生長(zhǎng)。但是在補(bǔ)料流加過程中，既不能加入得過快，也不能加入得過慢。過慢則無法滿足逐漸增加的菌體生長(zhǎng)需要，同時(shí)也使培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的抑制性副產(chǎn)物大量積累；而過快則使攜帶目的蛋白的質(zhì)粒沒有充裕的時(shí)間復(fù)制，降低目的蛋白的表達(dá)量；而且快速的細(xì)菌生長(zhǎng)還易引發(fā)質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。有報(bào)道表明，大腸桿菌通過分批補(bǔ)料發(fā)酵，每升培養(yǎng)液最高可得到50 g干菌種，A600 nm可達(dá)125左右。在我們實(shí)驗(yàn)中，嚴(yán)格控制補(bǔ)料流加的速度，在有效提高菌體產(chǎn)量的同時(shí)提高目的蛋白表達(dá)量。高密度發(fā)酵技術(shù)能夠減少培養(yǎng)體積,縮短生長(zhǎng)周期,減少設(shè)備投資并強(qiáng)化下游分離提取,為工業(yè)化生產(chǎn)降低成本。本文對(duì)重組DH5a/pKKH-BLyS的高密度、高表達(dá)發(fā)酵研究將可能對(duì)其它類型重組蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)具有一定的借鑒作用。References: 1 Moore P A, Belvedere O, Orr A, et al. 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