食品酶學(xué)食品酶學(xué)基礎(chǔ).ppt

第二篇 酶學(xué)基礎(chǔ),第四章 酶的分子結(jié)構(gòu)與催化功能,第一節(jié) 酶分子組成,酶,單純酶,結(jié)合酶,（全酶）= 酶蛋白 + 輔因子,輔因子,輔酶,與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機(jī)物。,輔基,與酶蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機(jī)物。,金屬激活劑,金屬離子作為輔助因子。,蛋白質(zhì)具有一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)以及大分子組織形式。 酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分。 輔因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體。,第二節(jié) 酶的結(jié)構(gòu)與功能,酶蛋白的結(jié)構(gòu),包括一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu),與酶的催化功能密切相關(guān)，結(jié)構(gòu)的改變會(huì)引起酶催化作用的改變或者喪失。 研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是酶學(xué)的核心課題。,一、酶的活性中心,（一）活性中心 酶蛋白上只有少數(shù)氨基酸殘基參與酶對(duì)底物的結(jié)合和催化，這些相關(guān)氨基酸殘基在空間上比較靠近，形成一個(gè)與酶顯示活性直接有關(guān)的區(qū)域（在酶分子表面上具有三維結(jié)構(gòu)的特定區(qū)域）,稱為酶的活性中心，又稱活性部位(active site）。 構(gòu)成活性中心的化學(xué)基團(tuán)實(shí)際上就是酶蛋白氨基酸殘基的側(cè)鏈，有時(shí)尚包括肽鏈末端的氨基酸。 胰凝乳蛋白酶活性中心含有Ile16、His57、Asp102、Asp194、ser195。在酶原形式時(shí)它們分散在一條肽鏈上,但酶原經(jīng)激活后，形成A、B、C三條肽鏈。前3個(gè)殘基在B鏈,后2個(gè)在C鏈。依靠肽鏈的折疊，包括肽鏈間的二硫鍵，使這些互相遠(yuǎn)離的基團(tuán)靠近。,(二)必需基團(tuán) 酶活性中心的一些化學(xué)基團(tuán)為酶發(fā)揮催化作用所必需，故稱為必需基團(tuán)。 在酶活性中心以外的區(qū)域，也有不和底物直接作用的必需基團(tuán)，稱為活性中心外的必需基團(tuán)。這些基團(tuán)與維持整個(gè)酶分子的空間構(gòu)象有關(guān)，間接地對(duì)酶的催化活性發(fā)揮作用。,Koshland將酶分子中的氨基酸殘基或其側(cè)鏈基團(tuán)分成四類：,1. 接觸殘基(contact residues) 如R1、R2、R6、R8、R9、R163、R164和R165。和底物直接接觸,參與底物的化學(xué)轉(zhuǎn)變，是活性中心的主要組成部分。這些殘基中的一個(gè)或幾個(gè)原子與底物分子的一個(gè)或多原子接觸的距離都是一鍵距離(即0.150.2nm)之內(nèi)。 2. 輔助殘基(auxiliary residues) 如R4，雖未直接與底物接觸，但在使酶與底物相互結(jié)合以及在輔助接觸殘基發(fā)揮作用上起著一定的作用。輔助殘基也是活性中心一個(gè)不可缺少的組成部分。 接觸和輔助殘基組成酶的活性中心。 接觸殘基的側(cè)鏈中，有的可能擔(dān)負(fù)和底物結(jié)合的作用, 稱為結(jié)合基團(tuán)；有的可能參與使底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的催化作用，稱為催化基團(tuán)。 結(jié)合基團(tuán)也可參與催化作用 輔助殘基，因不與底物接觸， 只能參與輔助催化基團(tuán)的作用，如質(zhì)子的供給或接受等。,3、結(jié)構(gòu)殘基(structural residues) 如R10、R162、R169等，這些殘基在維持酶蛋白形成一種有規(guī)則的空間構(gòu)象方面起著重要作用。對(duì)酶活性的顯示也有一定貢獻(xiàn)，但離底物分子較遠(yuǎn)，不能列人活性中心的范圍，屬于活性中心以外的必需基團(tuán)。 4、非貢獻(xiàn)殘基 (non-contributing residues) 在酶的活性中心外, 不參與酶的催化功能，對(duì)酶活性的顯示不起作用。如圖中的R3、R5、R7以及圖中未列入的一些殘基, 這些殘基可以被取代， 甚至把它們?nèi)サ粢膊粫?huì)對(duì)酶的構(gòu)象和功能產(chǎn)生重大改變。,二、酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系,一級(jí)結(jié)構(gòu)是酶的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，是催化功能的基礎(chǔ)。一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變將使酶的催化功能發(fā)生相應(yīng)的改變。,核糖核酸酶在其C末端用羧酸酶去掉3個(gè)氨基酸時(shí)，對(duì)酶的活性幾乎沒(méi)有影響，而若用胃蛋白酶去掉C末端的4個(gè)氨基酸時(shí)，則酶活性全部喪失。,核糖核酸酶，有活性,沒(méi)活性,有活性,酶原是活性酶的前體，需經(jīng)激活才顯示出酶的性。 由酶原轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚悦?，可通過(guò)酶或氫離子的催化而實(shí)現(xiàn)。 胰蛋白酶原在胰蛋白酶或腸激酶的作用下，使酶原變?yōu)榛钚缘拿浮Ｃ冈D(zhuǎn)變成酶時(shí)，一級(jí)結(jié)構(gòu)僅僅發(fā)生微小的變化，在碳鏈的N-末端失去了一個(gè)六肽，從而使隱蔽的活性基團(tuán)解放出來(lái),形成了活性部位。,許多酶都存在著二硫鍵。一般二硫鍵的斷裂將使酶變性而喪失其催化功能。但是某些情況下，二硫鍵斷開(kāi)，而酶的空間構(gòu)象不受破壞時(shí)，酶的活性并不完全喪失；如果使二硫鍵復(fù)原，酶又重新恢復(fù)其原有的生物活性。,三、酶的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系,二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)是所有酶都必須具有的空間結(jié)構(gòu),是維持酶的活性部位所必須的構(gòu)型。當(dāng)酶蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)徹底改變，就可使酶遭受破壞而喪失其催化功能。 二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，也可以使酶形成正確的催化部位而發(fā)揮其催化功能。由于底物的誘導(dǎo)而引起酶蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，與適應(yīng)的底物相互作用，從而形成正確的催化部位，使酶發(fā)揮其催化功能誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)的基礎(chǔ)。,1.酶的變性和失活,酶受到變性因素的作用，空間結(jié)構(gòu)破壞，其活性中心的構(gòu)象也隨著改變，酶因此失活。 有時(shí)只要維持酶活性中心各基團(tuán)的相對(duì)位置，即使一級(jí)結(jié)構(gòu)受到輕微破壞，酶活性也不會(huì)改變。 牛胰核糖核酸酶(RNA酶) 有4對(duì)二硫鍵及很多氫鍵維持其空間構(gòu)象; 活性中心中有兩個(gè)組氨酸（His12及His119）。用枯草桿菌蛋白酶處理，被水解成為N端的肽(S肽)和其余的104肽(S蛋白)兩個(gè)片段，分別含有His12和His119，兩者單獨(dú)存在時(shí)均無(wú)活力，但在pH7.0的介質(zhì)中，將兩者1:1混合，并使S肽與S蛋白間形成氫鍵及疏水鍵連接，則20與21位之間的肽鍵雖不能恢復(fù)，但活力能恢復(fù)。這是因?yàn)镾肽上的His12又與s蛋白上的His119互相靠近，恢復(fù)了原來(lái)活性中心的空間構(gòu)象。,酶蛋白的變性有時(shí)是可逆的。當(dāng)某些化學(xué)變性劑去除后，酶可以恢復(fù)原有的空間構(gòu)象，并恢復(fù)酶活力。 牛胰核糖核酸酶經(jīng)尿素及-巰基乙醇處理后發(fā)生變性，當(dāng)透析去除變性劑后，酶可自動(dòng)折疊成具有催化活性的原始形式。,2.活性中心的撓性,近年來(lái)的研究證明：酶蛋白活力的變化和變性時(shí)空間構(gòu)象的改變并不是同步的。 用紫外分光差光譜、熒光光譜、圓二色光譜、光散射和內(nèi)埋巰基暴露等手段研究肌酸激酶、核糖核酸酶、乳酸脫氫酶及3一磷酸甘油醛脫氫酶等在鹽酸胍和尿素溶液中變性不同時(shí)間的構(gòu)象變化(即肽鏈去折疊的過(guò)程)，同時(shí)測(cè)定酶活力的下降，發(fā)現(xiàn)：酶活力的喪失往往先于上述常規(guī)手段所測(cè)出的酶分子的整體構(gòu)象變化。 熱變性實(shí)驗(yàn)同樣證明，酶活性喪失在前，整體構(gòu)象變化在后。,進(jìn)一步用探測(cè)活性中心構(gòu)象的方法來(lái)研究(如3-磷酸甘油醛脫氫酶活性中心的巰基被羧甲基化后再經(jīng)激發(fā)光照，可在活性中心生成具有熒光的NAD共價(jià)結(jié)合物，可通過(guò)熒光改變來(lái)探測(cè)活性中心的構(gòu)象變化)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性中心的構(gòu)象的改變先于酶分子整體的構(gòu)象改變，而且與活力喪失幾乎同步。 即：酶的活性中心的空間結(jié)構(gòu)相對(duì)酶分子整體而言，處于分子中一個(gè)撓性的局部區(qū)域，是由較弱的化學(xué)鍵維持其空間結(jié)構(gòu)，對(duì)各種變性因素較為敏感。 低濃度的變性劑在一定條件有時(shí)反而使酶激活，也可證明活性中心的可塑性。,3.酶分子的結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域(domain)是指蛋白質(zhì)肽鏈中一段較獨(dú)立的具有完整、致密立體結(jié)構(gòu)的區(qū)域，一般由40400個(gè)氨基酸殘基組成。 大多數(shù)酶都有一個(gè)以上的結(jié)構(gòu)域，如彈性蛋白酶兩個(gè)十分類似的結(jié)構(gòu)域，而木瓜蛋白酶則有兩個(gè)很不一樣的結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)肽鏈的折疊和變構(gòu)調(diào)節(jié)等現(xiàn)象中具有重要作用。 不同的結(jié)構(gòu)域常有不同的功能。 在大多數(shù)蛋白激酶中，兩個(gè)不同功能的區(qū)結(jié)構(gòu)域一般都存在于一條肽鏈中，形成催化結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，如cGMP依賴的蛋白激酶G(PKG)，鈣-甘油二酶(佛波酯)一磷脂依賴的蛋白激酶C(PKC)以及具有酪氨酸蛋白激酶活性的表皮生長(zhǎng)因子受體，其調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域都位于N側(cè)，催化結(jié)構(gòu)域位于C側(cè)。,有一些多功能酶，其不同酶活力來(lái)自不同的結(jié)構(gòu)域，如大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶的C端切去6000分子量的片段后喪失了tRNA氨?；幕钚?，而但保留氨基酸活化和ATP-焦磷酸交換的活性。 已發(fā)現(xiàn)與凝血及纖維蛋白溶解有關(guān)的蛋白酶由6種不同的結(jié)構(gòu)域以不同的組合方式裝配而成，包括:一羧基谷氨酸域、表皮生長(zhǎng)因子域、三環(huán)(kringle)結(jié)構(gòu)域、指(finger)結(jié)構(gòu)域和接觸因子(CF)域以及類胰蛋白酶的催化域。 不同蛋白酶中的相同結(jié)構(gòu)域則往往有相同或類似的功能。可以把結(jié)構(gòu)域看成是酶蛋白中的一個(gè)功能單位。 對(duì)結(jié)構(gòu)域的研究正方興未艾，將來(lái)有可能利用不同的結(jié)構(gòu)域用DNA重組技術(shù)組裝成新的人工酶蛋白。,四、酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)與催化功能的關(guān)系,具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的酶，按其功能可分為兩類：一類與催化作用有關(guān)，另一類與代謝調(diào)節(jié)關(guān)系密切。 只與催化作用有關(guān)的具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的酶：由數(shù)個(gè)相同的亞基組成，每個(gè)亞基都有一個(gè)活性中心。四級(jí)結(jié)構(gòu)完整時(shí)，酶的催化功能才會(huì)充分發(fā)揮出來(lái)。當(dāng)四級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，亞基被分離，若采用的分離方法適當(dāng)，被分離的亞基仍保留著各自的催化功能。 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶用溫和的琥珀酸的方法使四級(jí)結(jié)構(gòu)解離時(shí)，分離得到的亞基仍各自保持催化功能；當(dāng)用強(qiáng)烈的條件如酸、堿、表面活性劑等破壞其四級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，得到的亞基沒(méi)有催化活性。 與代謝調(diào)節(jié)有關(guān)的具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的酶：其組成亞基中，有的亞基具有調(diào)節(jié)中心（激活中心和/或抑制中心），使酶的活性受到激活或者抑制，調(diào)節(jié)酶反應(yīng)的速度和代謝過(guò)程。,第三節(jié) 酶催化作用的基本理論,有過(guò)各種酶催化學(xué)說(shuō)。早期學(xué)說(shuō)的中心思想是底物的活化，到世紀(jì)60年代，隨著新技術(shù)的發(fā)展，從而亦考慮到在催化反應(yīng)中，酶本身功能基團(tuán)的作用。 酶在進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，首先和底物形成ES絡(luò)合物，這樣分子間的催化反應(yīng)就變?yōu)榉肿觾?nèi)的催化反應(yīng)。,一、酶底物復(fù)合物,酶與底物結(jié)合形成中間復(fù)合物（或稱中間絡(luò)合物）。 復(fù)合物的形成是專一性決定的過(guò)程，也是變分子間反應(yīng)為分子內(nèi)反應(yīng)的過(guò)程，同時(shí)又是誘導(dǎo)契合過(guò)程。由于中問(wèn)復(fù)合物的形成，酶和底物的結(jié)構(gòu)都將發(fā)生有利于催化反應(yīng)進(jìn)行的變化。,（一）酶一底物復(fù)合物存在的證據(jù),光譜技術(shù)是證明ES復(fù)合物存在的有效手段。 醇脫氫酶（ADH）的底物NADH在游離狀態(tài)下，于340nm處有一吸收峰，但加入ADH后,吸收峰移向328nm，再加入巰基試劑對(duì)氯汞苯甲酸又使吸收峰回到340nm，證明NADH和ADH的結(jié)合是通過(guò)ADH的巰基介導(dǎo)的。 催化絲氨酸和吲哚合成色氨酸的色氨酸合成酶含有磷酸吡哆醛輔基，后者能在激發(fā)下發(fā)出熒光。當(dāng)單加入絲氨酸而尚無(wú)吲哚時(shí), 其熒光強(qiáng)度顯著增加，再加入吲哚，就使熒光淬滅，低于單獨(dú)酶的熒光，這就證明酶-絲氨酸復(fù)合物和酶-絲氨酸-吲哚復(fù)合物的存在。,大分子底物和酶的復(fù)合物可用電子顯微鏡直接觀察 DNA聚合酶與DNA的復(fù)合物。即使小分子底物也可用X射線衍射法獲得酶-底物復(fù)合物的信息，如羧肽酶A是通過(guò)哪些殘基和底物甘氨酰-L-酪氨酸結(jié)合的以及溶菌酶的最小六糖底物是怎樣“躺”在酶分子表面的狹長(zhǎng)凹穴中，目前都已研究清楚。 有些雙底物的酶可在只有一種底物的情況下加以提純或結(jié)晶，如3一磷酸甘油醛脫氫酶需要加入一定量的NAD+才能結(jié)晶，這也是酶一底物復(fù)合物的直接證據(jù)。 現(xiàn)已充分證明:底物是通過(guò)酶的活性中心和酶結(jié)合的。,(二)酶與底物形成復(fù)合物的作用力,酶與底物的結(jié)合與穩(wěn)定酶分子的三維結(jié)構(gòu)的力是相同的。 1.離子鍵 底物分子上的電荷和酶分子上相反電荷之間的作用, 離子鍵受溶劑、鹽濃度、酶活性部位的微環(huán)境以及酶活性部位的側(cè)鏈基團(tuán)等因素的影響。 2.氫鍵 底物和酶結(jié)合的一種重要的相互作用力。 酶分子可以在主鏈與側(cè)鏈之間以及某些側(cè)鏈之間形成氫鍵。氫鍵在水中仍然可以保持，但強(qiáng)度減弱。在酸、堿液中氫鍵不存在。在高溫或各種變性劑的作用下，氫鍵會(huì)被破壞。 3.范德華力 一種非專一性的相互作用力，比離子鍵和氫鍵都弱。 酶與底物之間的有效范德華引力作用,，只有在它們相互之間處于立體互補(bǔ)的情況下才能發(fā)生作用。在酶和底物的結(jié)合過(guò)程中，許多原子基團(tuán)間的范德華引力的總和將會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)大的作用。,二、酶的催化作用本質(zhì),酶和一般催化劑的共性 用量少而催化效率高； 它能夠改變化學(xué)反應(yīng)的速度，但是不能改變化學(xué)反應(yīng)平衡。酶本身在反應(yīng)前后也不發(fā)生變化。 酶能夠穩(wěn)定底物形成的過(guò)渡狀態(tài)，降低反應(yīng)的活化能，從而加速反應(yīng)的進(jìn)行。,一般催化劑 反應(yīng)活化能,反應(yīng)總能量變化,酶促反應(yīng)活化能,非催化反應(yīng)活化能,初 態(tài),終 態(tài),能 量 改 變,活 化 過(guò) 程,酶促反應(yīng)活化能的改變,過(guò)渡態(tài),三、酶作用的專一性機(jī)制,（一）酶作用的專一性（底物特異性）（Substrate-specificity）,（1）低特異性（Low specificity）:不能辨別底物，僅能對(duì)裂開(kāi)的鍵表現(xiàn)特異性，如非特異性脂酶。 （2）基團(tuán)特異性（Group specificity）: 對(duì)于相鄰于特定基團(tuán)的一個(gè)特殊的化學(xué)鍵表現(xiàn)出特異性。 胰蛋白酶對(duì)羧基一側(cè)為精氨酸和賴氨酸的肽鍵表現(xiàn)特異性。 O X-NH-CH-C-NH-CH-COOH (精氨酸或賴氨酸) | | R1 R2,。,（3）絕對(duì)特異性（Absolute specificity） 酶僅作用于一種底物并催化一個(gè)反應(yīng)。例如，脲酶只能催化脲素水解，不能催化甲基脲水解。,（4）立體化學(xué)特異性（Stereochemical specificity） 通常顯示出正確無(wú)誤和完全的立體定向性，能區(qū)別光學(xué)或立體異構(gòu)體。幾乎總是選擇一對(duì)對(duì)映體中的一種形式做底物，除非酶的特異功能是催化對(duì)映體的異構(gòu)化。,（二）酶作用的專一性機(jī)制,有多種學(xué)說(shuō)，得到廣泛支持的有： 鎖鑰學(xué)說(shuō) 誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō) 過(guò)渡態(tài)學(xué)說(shuō) 共同點(diǎn)： 酶的作用專一性必須通過(guò)它的活性中心和底物結(jié)合后才表現(xiàn)出來(lái)。,1.鎖鑰學(xué)說(shuō),1894年，德國(guó)有機(jī)化學(xué)家E.Fisher提出。 酶與底物結(jié)合時(shí)，酶活性中心的結(jié)構(gòu)與底物的結(jié)構(gòu)必須吻合， 就如同鎖和鑰匙一般，非常配合地結(jié)合形成中間復(fù)合物)。當(dāng)中間復(fù)合物形成時(shí)，會(huì)促進(jìn)底物結(jié)構(gòu)發(fā)生某些化學(xué)變化(如底物分子的鍵被扭曲)，變形而斷裂，轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。 可解釋酶的立體化學(xué)專一性和底物飽和曲線動(dòng)力學(xué)。,在酶的表面存在著一個(gè)特殊形狀的活性部位，這個(gè)活性部位在結(jié)構(gòu)上能與底物精確地互補(bǔ)。底物與酶之間存在某種立體專一結(jié)合。底物類似鑰匙，酶類似鎖。,獲得相當(dāng)多的事實(shí)支持。 乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解。要求底物中的膽堿氮帶正電，為此可推測(cè)：酶分子中至少有一個(gè)陰離子部位與酯解部位。事實(shí)是，這兩部位間有嚴(yán)格的距離，膽堿和?；g多或少一個(gè)-CH2-都不適于作底物或競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，而符合這種鍵長(zhǎng)、鍵角要求的化合物都能與該酶發(fā)生作用（被酶催化水解或者抑制酶）。 缺點(diǎn)： 認(rèn)為酶的結(jié)構(gòu)是剛性的， 難以解釋一個(gè)酶可以催化正、逆兩個(gè)反應(yīng)，因產(chǎn)物(或逆反應(yīng)的底物)的形狀、構(gòu)象和底物完全不同。,2.誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō),1958年，Koshand提出 酶分子(包括輔酶在內(nèi))的構(gòu)象與底物原來(lái)并非恰當(dāng)吻合，只有底物分子與酶分子相碰時(shí)，才可誘導(dǎo)后者的構(gòu)象變得能與底物配合， 然后才結(jié)合形成中間復(fù)合物，進(jìn)而引起底物分子發(fā)生相應(yīng)的化學(xué)變化。,誘導(dǎo)楔合模型要點(diǎn)： （a）當(dāng)?shù)孜锱c酶的活性部位結(jié)合時(shí)，酶蛋白的幾何形狀有相當(dāng)大的改變； （b）催化基團(tuán)的精確定向?qū)τ诘孜镛D(zhuǎn)變成產(chǎn)物是必需的； （c）底物誘導(dǎo)酶蛋白幾何形狀的改變使得催化基團(tuán)能精確地走向和底物結(jié)合到酶的活性部位上去。,A、B催化基團(tuán),C結(jié)合基團(tuán),在用X光衍射法研究溶菌酶、彈性蛋白酶等與底物結(jié)合后結(jié)構(gòu)的改變中得到了證實(shí)。 能解釋鎖鑰學(xué)說(shuō)不能解釋的實(shí)驗(yàn)事實(shí)，但也有局限性： 不是酶的底物或酶的抑制物，不能誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化，或即使有少許變化，也不能使酶分子與有關(guān)催化基團(tuán)處于互補(bǔ)契合位置。 實(shí)際上，大于底物或小于底物的類似物亦能誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象發(fā)生變化。,3.過(guò)渡態(tài)學(xué)說(shuō)(transition state theory),Linus Pauling （20世紀(jì)40年代）提出的過(guò)渡態(tài)理論認(rèn)為：酶與底物的過(guò)渡態(tài)互補(bǔ)，親和力最強(qiáng)，釋放出結(jié)合能使ES的過(guò)渡態(tài)能級(jí)降低，有利于底物分子跨越能壘，使酶促反應(yīng)大大加速。 “過(guò)渡態(tài)”是反應(yīng)物分子處于被激活的狀態(tài)，是反應(yīng)途徑中分子具有最高能量的形式。不同于反應(yīng)中間物。它只不過(guò)是一個(gè)短暫的分子瞬間。在這一瞬間分子的某些化學(xué)鍵正在斷裂和形成并達(dá)到能崩解生成產(chǎn)物或再返回生成反應(yīng)物的程度。 過(guò)渡態(tài)學(xué)說(shuō)認(rèn)為，酶的作用專一性既寓于酶與底物的結(jié)合，也寓于酶對(duì)底物的催化，酶與底物的結(jié)合不僅促成了結(jié)合基團(tuán)和催化基團(tuán)的正確取位，同時(shí)也為下一步酶對(duì)底物的催化做了準(zhǔn)備。,.表示正在形成和斷裂的化學(xué)鍵,乙酸乙酯的水解反應(yīng):,過(guò)渡態(tài)看來(lái):,過(guò)渡態(tài)是一種變動(dòng)的分子。,20世紀(jì)70年代以來(lái)，對(duì)很多酶促反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)類似物(人工設(shè)計(jì)出的類似過(guò)渡態(tài)的穩(wěn)定分子)的研究發(fā)現(xiàn)，這些過(guò)渡態(tài)類似物與酶的結(jié)合比底物與酶的結(jié)合緊密102106倍，證明了酶與反應(yīng)過(guò)渡態(tài)互補(bǔ)的概念是正確的。 過(guò)渡態(tài)學(xué)說(shuō)涵蓋了對(duì)專一性機(jī)制和對(duì)高效性機(jī)制的解說(shuō)。,第四節(jié) 酶在生物體內(nèi)存在的幾種形式 一、單體酶、寡聚酶和多酶復(fù)合物,酶和其他蛋白質(zhì)一樣，由種L-氨基酸組成,也有特定的氨基酸排列和特定的空間結(jié)構(gòu)。根據(jù)酶蛋白分子結(jié)構(gòu)可將酶分為三類。 單體酶 寡聚酶 多酶復(fù)合物,（一）單體酶(monomeric enzyme),僅有一條具有活性部位的多肽鏈，全部參與水解反應(yīng)。,（二）寡聚酶（oligomeric enzyme）,寡聚酶具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，至少有2個(gè)亞基,多的可達(dá)60個(gè)以上，相對(duì)分子質(zhì)量在3.5萬(wàn)至百萬(wàn)以上。組成寡聚酶的亞基可以相同，也可以不同。亞基之間以非共價(jià)鍵結(jié)合。 有的亞基上有結(jié)合基團(tuán)，叫結(jié)合亞基，有的亞基上有催化基團(tuán)，叫催化亞基。 亞基分離時(shí)沒(méi)有活性。,（三）多酶復(fù)合體(multienzyme complex),多酶復(fù)合體是指幾個(gè)酶嵌合而成的絡(luò)合物，又稱多酶絡(luò)合物。一般由26個(gè)功能相關(guān)的酶組成，有利于生化反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行，以提高酶的催化效率，同時(shí)也便于機(jī)體對(duì)酶的調(diào)控。,二、同工酶（isozyme）,同工酶是指能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同的一組酶。 由于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同，各同工酶的理化性質(zhì)、免疫學(xué)性質(zhì)都存在很多差異。 同工酶不僅存在于同一機(jī)體的不同組織中，也存在于同一組織細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。 已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的同工酶達(dá)數(shù)百種，其中研究得最多的是乳酸脫氫酶(LDH)。哺乳動(dòng)物中有5種乳酸脫氫酶同工酶. NAD+ NADH + H+ CH3-CHOH-COOH CH3-CO- COOH 乳酸 丙酮酸,用電泳法分離LDH可得到5種同工酶區(qū)帶。都是由H和M二種不同類型的亞基組成的四聚體。,乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜,同工酶的測(cè)定可作為某些疾病的診斷指標(biāo)。 正常人血清LDH主要來(lái)自紅細(xì)胞滲出，活力很低。當(dāng)某一組織病變時(shí)，血清LDH同工酶電泳圖譜會(huì)發(fā)生變化。如肝細(xì)胞受損早期，LDH總活性在正常范圍內(nèi)，但LDH5升高；急性心肌病變時(shí)，LDHl可升高。,同工酶的測(cè)定在食品檢測(cè)和鑒別中得到日益廣泛的應(yīng)用 食用菌菌種純度的同工酶電泳鑒定 利用同工酶對(duì)食用菌進(jìn)行分類研究旨在探求不同菌種的酶譜差異，從而界定其親緣關(guān)系，以改善目前市場(chǎng)上食用菌菌種管理混亂、分類不清、甚至同種異名的現(xiàn)狀。 選取目前銷售、應(yīng)用較為廣泛、代表性強(qiáng)的平菇和香菇菌種，測(cè)定其液培菌絲的酯酶和過(guò)氧化物酶譜帶。,蜂蜜品質(zhì)同工酶電泳檢測(cè) 比較兩種天然蜂蜜與摻假所用的工業(yè)淀粉酶的同工酶電泳，發(fā)現(xiàn)天然蜂蜜的淀粉酶同工酶酶譜和工業(yè)淀粉酶的同工酶酶譜存在差異。,三、別構(gòu)酶與修飾酶,別構(gòu)酶(變構(gòu)酶)與修飾酶統(tǒng)稱為調(diào)節(jié)酶。調(diào)節(jié)酶通常在一連串的反應(yīng)中催化單向反應(yīng)，或催化反應(yīng)速度最慢的反應(yīng)步驟。其活性的改變可以決定全部反應(yīng)的總速度，甚至可以改變代謝的方向，故又稱為限速酶(或關(guān)鍵酶)。,（一）別構(gòu)酶（allosteric enzyme）,一類較復(fù)雜的寡聚酶，除具有活性中心外，還具有別構(gòu)中心。 活性中心負(fù)責(zé)對(duì)底物結(jié)合和催化，別構(gòu)中心則與調(diào)節(jié)催化速度有關(guān)。當(dāng)某些代謝物以非共價(jià)方法結(jié)合于別構(gòu)中心部位后，可使酶蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶活性，這種效應(yīng)稱為別構(gòu)效應(yīng)。 可發(fā)生別構(gòu)效應(yīng)的酶稱為別構(gòu)酶，可引發(fā)別構(gòu)效應(yīng)的代謝物稱為別構(gòu)效應(yīng)劑。 別構(gòu)酶通常由多個(gè)亞基組成，活性中心和別構(gòu)中心可分布在不同的亞基，也可分布在同一亞基的不同部位，能結(jié)合別構(gòu)效應(yīng)劑的亞基為別構(gòu)亞基。 別構(gòu)效應(yīng)劑一般為小分子代謝物，可以是別構(gòu)酶的底物，也可以是代謝通路上的產(chǎn)物。根據(jù)別構(gòu)效應(yīng)劑與酶結(jié)合后的效果，可將其分為兩類，使酶活性升高者稱為別構(gòu)激活劑，使酶活性降低者稱為別構(gòu)抑制劑。 異檸檬酸脫氫酶是別構(gòu)酶，NAD+、ADP和檸檬酸是該酶的別構(gòu)激活劑，而NADH和ATP是別構(gòu)抑制劑。,（二）修飾酶(modification enzyme),1、修飾酶的類型 某些酶能在其他酶的催化下，通過(guò)共價(jià)鍵可逆結(jié)合某種化學(xué)基團(tuán)，從而改變其活性，這種作用稱為共價(jià)修飾調(diào)節(jié)，這類酶稱為共價(jià)修飾酶或化學(xué)修飾酶。 修飾酶活性的改變是通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，別構(gòu)酶活性的改變是通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合。 修飾酶的共價(jià)修飾有磷酸化/脫磷酸化、乙?；?去乙?；?、腺苷化/去腺苷化、甲基化/去甲基化、-SH/- S-S-等，其中磷酸化/脫磷酸化最為常見(jiàn)。,2、修飾酶的特點(diǎn),（1）絕大多數(shù)修飾酶具有無(wú)活性/有活性(或低活性/高活性)兩種形式，催化其正逆兩方向反應(yīng)的酶不同，且受激素或第二信使的調(diào)節(jié)。 （2）耗能少 磷酸化/脫磷酸化是最常見(jiàn)的共價(jià)修飾。每個(gè)亞基磷酸化僅僅需1分子ATP，比生物合成多肽鏈消耗的ATP少得多，速度也快得多。 （3）效率高 由于化學(xué)修飾反應(yīng)一般是酶促反應(yīng)，且受體內(nèi)調(diào)節(jié)因子控制，故對(duì)調(diào)節(jié)信號(hào)有快速、放大的效應(yīng)。體內(nèi)酶促化學(xué)修飾反應(yīng)往往是連鎖反應(yīng)，即一種酶經(jīng)化學(xué)修飾后，被修飾的酶又可催化另一種酶分子進(jìn)行化學(xué)修飾，每修飾一次就產(chǎn)生一次放大效應(yīng)。因此，極少量的調(diào)節(jié)因子經(jīng)化學(xué)修飾酶的逐級(jí)放大，可產(chǎn)生顯著的生理效應(yīng)。,環(huán)磷腺苷,四、結(jié)構(gòu)酶(組成酶)與誘導(dǎo)酶,根據(jù)合成與代謝的關(guān)系，將酶相對(duì)地分為結(jié)構(gòu)酶和誘導(dǎo)酶。 結(jié)構(gòu)酶(structural enzym)是細(xì)胞以恒定速率和恒定數(shù)量生成的那些酶類，亦稱組成酶。細(xì)胞中天然存在, 含量較穩(wěn)定， 一般不受外界條件的影響。 誘導(dǎo)酶(induced enzyme)是指細(xì)胞中進(jìn)入特定的誘導(dǎo)物后, 被誘導(dǎo)生成的。其有無(wú)及含量的多少受外界條件的影響。 在某