《流式細胞術》PPT課件.ppt

流式細胞術,（ Flow Cytometry ,FCM）,利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速（每秒可達1000-10000個）的定量分析和分選（純度可達99%以上）的技術。,熒光信號主要包括兩部分：自發(fā)熒光，即不經熒光染色細胞內部的熒光分子經光照射后所發(fā)出的熒光；特征熒光，即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。,標本處理,免疫熒光標記 直接免疫熒光標記 間接免疫熒光標記,流式細胞術常規(guī)檢測時的樣品制備,（一）直接免疫熒光標記法 取一定量細胞(約1X106細胞ml)，在每一管中分別加入50l的HAB，并充分混勻，于室溫中靜置1分鐘以上,再直接加入連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應(如做雙標或多標染色，可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入) 。孵育20-60分鐘后，用PBS(pH7274)洗1-2次，加入緩沖液重懸，上機檢測。,直接熒光標記法操作簡便，結果準確，易于分析，適用于同一細胞群多參數(shù)同時測定。雖然直標抗體試劑成本較高，但減少了間接標記法中較強的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標本的檢測。,(二)間接免疫熒光標記法 取一定量的細胞懸液(約1X106細胞ml)，先加入特異的第一抗體，待反應完全后洗去未結合抗體，再加入熒光標記的第二抗體，生成抗原抗體抗抗體復合物，以FCM檢測其上標記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。,本方法費用較低，二抗應用廣泛，多用于科研標本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結果。所以標本制備時應加入陰性或陽性對照。另外，由于間標法步驟較多，增加了細胞的丟失，不適用測定細胞數(shù)較少的標本。,最小化非特異性結合的方法,常用的熒光染料（488波長激發(fā)）,熒光染料 激發(fā)波長 (nm) 發(fā)射波長(nm) 用途 顏色 FITC 488 525 免疫熒光 綠色 PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色 ECD 488 620 免疫熒光 橙紅 PeCy5 488 675 免疫熒光 紅 PI 488 620 DNA染色 橙紅 PECy7 488 755 免疫熒光 深紅 7AAD 488 675 區(qū)分死細胞 其中PE最強，使用于弱表達抗原 FITC最便宜，使用于強表達抗原,培養(yǎng)細胞,制作細胞懸液 300-400目濾網過濾 免疫熒光標記 上機,流式細胞術檢測培養(yǎng)細胞表面抗原的樣品制備方法探討,應用EDTA、胰酶、細胞刮、聯(lián)用EDTA及細胞刮制備 單用EDTA或細胞刮制備的細胞懸液中細胞產量低,胰酶或聯(lián)用EDTA及細胞刮制備的細胞懸液中細胞產量高(F=263.63,P0.001).胰酶組細胞表面HLA-DR和ICAM-1的熒光強度明顯降低,且以HLA-DR抗原下降比例較多(HLA-DR:F=3.77,P=0.022;CD54:F=10.33,P0.001).EDTA組、細胞刮組、EDTA聯(lián)合細胞刮組間HLA-DR和ICAM-1的熒光強度表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05).結論:EDTA聯(lián)合細胞刮法是貼壁培養(yǎng)細胞制備單細胞懸液的一種好方法,操作步驟,制備活性高的細胞懸液(培養(yǎng)細胞系、外周血單個核細胞、 胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法) 用10FCS RPMI1640調整細胞濃度為 51010ml 取40l細胞懸液加入預先有特異性McAb(550l) 的小玻璃管或塑料離心管，再加50l 120(用DPBS 稀釋)滅活正常兔血清 4 30min 用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右 1000rpm5min 棄上清，加入50l工作濃度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)熒光標記物，充分振搖 4 30min 用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右 1000rpm5min 加適量固定液(如為FCM制備標本，一般加入 1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察， 視細胞濃度加入100500l固定液) FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察 (標本在試管中可保存57天),注意事項,1. 整個操作在4下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。 2. 洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現(xiàn)假陰性。 3. 加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。 4. 細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。,注意事項,細胞數(shù)目，標記細胞數(shù)目在5*105到1*106內為宜，將液體量控制在100-200微升。 必須經過微柵過濾。 培養(yǎng)細胞類型，大小。 注意孵育條件，試劑說明上都有標記，大多數(shù)為室溫，避光孵育，有的試劑要求4條件下孵育。 陰性對照。,血細胞 流式檢測,抗凝。 除紅細胞標記檢測外需要溶血。 血標本取出后6小時內進行熒光染料標記，溶血固定后（含多聚甲醛）可保存2-3天。 注意孵育環(huán)境，試劑說明上都有標記，大多數(shù)為室溫，避光孵育，有的試劑要求4條件下孵育。 標記細胞數(shù)目在5*105到1*106內為宜，將液體量控制在100-200微升。 如血標本中有血凝塊或其他絮狀物、沉淀不可上機檢測，以防止堵塞流路通道。,氯化銨溶血劑(Ammonium chloride lysing solution,),貯存液(10)： 80.2g NH4Cl (1.5M) 8.4g NaHCO3(100mM) 3.7g EDTA Na2(10mM) 蒸餾水900 ml 調節(jié)pH至7.4 (用1N HCl 或NaOH) 加蒸餾水至1升 4oC保存6個月以內 工作液(1)：蒸餾水1:9稀釋, 新鮮配制, 冷藏保存 注: 1) 貯存液不可小于10, 否則會形成碳酸銨而失效 2) NaHCO3可由10g KHCO3替代, EDTA Na2可由3.66g EDTA Na4(8.2mM)替代,用氯化銨溶血劑的溶血方法,100ml 全血加2mL氯化銨溶血劑, 混勻 2) 避光孵育1015分鐘 3) 離心, 去上清, PBS洗2次 4) 抗體染色后, PBS洗 5) 1ml 1%多聚甲醛固定, 2oC-直至上機檢測,細胞凋亡 流式檢測,固定細胞的染色方法 非固定細胞的染色方法,固定細胞的染色方法,PI單染色法 （1）,1收集細胞（15）106個，5001000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。 23ml PBS洗一次。 3離心去PBS，加入冰預冷的70的乙醇固定，4，1h。 4離心棄去固定液，3ml PBS重懸5min。 5400目的篩網過濾1次，5001000r/min離心5min，棄去PBS。 6用1ml PI染液，4避光30min。 7流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產生紅色熒光，可分析前散射光對側散射光的散點圖及PI熒光的直方圖。,PI單染色法 （2）,1收集細胞（1106個），5001000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。 21ml PBS/FCS洗一次。 35001000r/min離心5min去PBS/FCS，加入500l PBS/FCS和500l的多聚甲醛固定液，輕輕混勻，在4下固定4min。 45001000r/min離心5min棄去固定液，室溫加入含0.2 Tween的PBS 1ml，37孵育15min。 51ml PBS/FCS洗3次，每次5min。 6400目的篩網過濾1次。 75001000r/min離心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4避光至少30min。染色在24h之內皆可行，流式細胞儀分析。,調亡細胞的TUNEL的流式細胞儀分析,1離心收集細胞，PBS洗12次。 21多聚甲醛低溫下固定15min。 33ml PBS洗1次，70乙醇固定，冰箱內放置13天。 4PBS輕洗1次 5細胞與TdT標記液37孵育，時間12h。 6PBS輕洗1次。 7細胞在黑暗中37與100l的染色緩沖液孵育30min。 8含0.1 Triton-X 100的PBS輕洗1次。 91ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重懸。 10 流式細胞儀分析紅色（PI）對綠色熒光（FITC）的地形圖。,ISNT的流式細胞儀分析,1離心收集細胞，PBS洗12次 21多聚甲醛低溫下固定15min。 33ml PBS洗1次，70乙醇固定，冰箱內放置13天。 4PBS輕洗1次。 52105細胞與12.5l的缺口平移緩沖液在15共孵育6h，每過15min振動1次。 6PBS輕洗1次。 7細胞在黑暗中37與100l的染色緩沖液孵育30min。 8含0.1 Triton-X 100的PBS輕洗1次。 91ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重懸。 10 流式細胞儀分析紅色（PI）對綠色熒光（FITC）的地形圖,非固定細胞的染色方法,Hoechst 33342/PI雙染色法,1懸浮生長的細胞在培養(yǎng)狀態(tài)下加入Heochst 33342，終濃度為1g/ml；帖壁生長的細胞用含有0.02EDTA的0.25胰蛋白酶消化成單細胞懸液，離心，棄上清，用1ml全培養(yǎng)液重懸細胞，加入Heochst 33342，終濃度為1g/ml，37孵育710min。 24 5001000r/min離心棄去染液。 3加入1.0ml PI染液，4避光染色15min。 4400目的篩網過濾1次。 5流式細胞儀分析。,Annexin V/PI雙染色法,1細胞收集：懸浮細胞直接收集10ml的離心管中，而帖壁細胞先用滴管輕輕吹打，調亡細胞一經吹打可能脫壁，收集到10ml的離心管中，沒脫壁的細胞用0.02的EDTA消化使之脫壁，每樣本細胞數(shù)為（15）106，5001000r/min離心5min棄去培養(yǎng)液。 2用孵育緩沖液洗1次，5001000r/min離心5min。 3用100l的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育1015min。 45001000r/min離心5min沉淀細胞，孵育緩沖液洗1次。 5加入熒光溶液4下孵育20min，避光并不時振動。,細胞因子檢測,常用的標本類型和處理方法 全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時內分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少5%。如不能在8小時之內檢測，應將真空采血管水平室溫放置。 自身血漿中外周血單個核細胞(PBMCs)：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時內分析。 組織培養(yǎng)基中的外周血單個核細胞(PBMCs)：用Ficoll分離PBMCs，將細胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中，調節(jié)細胞濃度為2106細胞/ml。 細胞系與T細胞克?。赫{節(jié)細胞濃度2106細胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。 冰凍全血與PBMCs：使用1紅細胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重懸，70凍存。溶化后細胞置于染色管中，加上23mL的洗液，離心5分鐘后，用破膜劑對細胞進行破膜和染色。,流式檢測細胞染色基本過程（以全血為例）,1、收獲細胞：肝素鈉抗凝的靜脈血，按1：1與培養(yǎng)基混勻，加刺激劑，同時加蛋白轉運抑制劑（參照說明書）， 混勻后，37，5%二氧化碳培養(yǎng)4-6小時 2、阻斷Fc受體：用于消除非特異性的結合染色 在小鼠，可使用純化的FcII/III受體的抗體（CD16/32），按照1ug/106細胞的用量，在染色緩沖液中4孵育15分鐘，PBS清洗后，直接進行下一步染色。 對于人和大鼠，可直接使用過量的與熒光抗體相同來源和亞型不相關的純化Ig或者血清進行阻斷 3、細胞表面染色 加適當?shù)募毎砻嫒旧噭?0L于Falcon管中，加入100L激活后的全血 (細胞濃度維持在2106/mL) 混勻，室溫暗處孵育15分鐘； 加入溶血素，室溫暗處孵育10分鐘。（注意：PMA激活的全血可能會溶血不完全。） 離心500g 5分鐘，棄上清 4、固定和破膜 加固定劑，室溫暗處孵育15分鐘，離心500g 5分鐘，棄上清； 加破膜劑溫暗處孵育10分鐘。（劑量參照說明書） 加23mLPBS洗液，離心500g 5分鐘，棄上清。 5、細胞內染色 加入熒光標記的細胞因子抗體，混勻，室溫暗處孵育30分鐘。 加23mL洗液，離心500g 5分鐘，棄上清，加入500LPBS上機或加入500L 1% PFA固定后再上機,流式細胞術分析血小板,全血樣本的制備 1.抽取抗凝全血：檢測血小板功能時，應使用標準化的抽血規(guī)程。做血小板活化試驗時，應盡量減少人為造成的血小板活化。 2.Falcon管中加取全血和適量直標熒光抗體，充分混勻，室溫避光處反應，通常放置15分鐘。 3.1%多聚甲醛固定樣本。 4.上機檢測,質控標本,.陰性對照(Isotype Control)：非特異熒光的強弱取決于抗體濃度、單克隆熒光抗體特異性和純度，應與試驗管抗體相對應。在多色分析時，同型對照應與其它抗體同時使用，以避免補償造成的誤差。 2. 血小板體外活化試驗：使用正常人活化標本作為陽性質控。使用正常人未活化標本作為陰性質控。 3. 血小板自身抗體檢測：使用含有已知血小板抗體的血清與血小板孵育，作為陽性質控。使用不含血小板抗體的血清與血小板孵育，作為陰性質控。 4. 血小板表面抗原缺失：如巨血小板癥血小板表面CD42a