酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法.ppt

酶聯(lián)免疫吸附測定法,生物體系中的化學測量,裴丹青03081152,復雜生物體系中生命物質的化學測量是揭示生命奧秘的重要手段，在食品檢驗、疾病診斷和預防的過程中也日益凸現(xiàn)其重要作用。,經(jīng)典的化學分析方法（滴定分析、重量分析、簡單的吸光光度法）是以簡單離子或分子為檢測對象的常量或微量分析，面對生物體系成分復雜且待測物濃度較低的測試條件則往往無能為力。,于是，一系列針對生物體系中化學成分的測量方法應運而生。免疫化學分析即其重要成員，它將免疫學知識與化學分析手段有機結合，為生命體系中高特異性、超微量的分析提供了解決方法。,什么是 酶聯(lián)免疫分析技術,ELISA的基本原理和方法,ELISA的種類和變化,ELISA的特點,ELISA的應用實例,1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者Van Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學領域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術( immunoenzymatic techniques ) 的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術 。,一、基本原理 它采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。,在這種測定方法中有3種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標記的抗原或抗體（標記物） 酶作用的底物（顯色劑）,測量時，抗原（抗體）先結合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結合成的偶聯(lián)物（標記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應結合后，,再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。,其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。 其方法簡單，方便訊速，特異性強。,二、酶及其底物 酶結合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物 ，將得到不同的顏色反應.,ELISA的種類和變化,（一）雙抗體夾心法 （二）間接法 （三）競爭法 （四）雙位點一步法 （五）捕獲法測IgM抗體 （六）應用親和素和生物素的ELISA,（一）雙抗體夾心法,此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原,獲得待分析物的未標定抗體,將特異性抗體與固相 載體連接形成固相抗體,洗滌除去未結合的 抗體及雜質,加入封閉蛋白溶液以封閉載體 表面殘留的蛋白結合位點,洗滌并除去未結合的封閉蛋白,加受檢標本（抗原）形成 固相抗體抗原復合物,洗滌除去其他 未結合的物質,加酶標抗體生成 抗體待測抗原酶標記抗體 的復合物,徹底洗滌 未結合的 酶標抗體,加底物進行 酶催化反應,根據(jù)顏色反應的 程度進行該抗原 的定性或定量測定,間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。,（二）間接法,包被固相載體: 用已知抗原包被 固相載體,加待檢標本: 使相應抗體與固相抗原結合 洗滌，除去無關的物質,加酶標抗抗體: 與固相載體上抗原抗體 復合物結合；洗滌，除去 未結合的酶標抗抗體,加底物 顯色,根據(jù)顏色反應的程度進行 該抗原的定性或定量測定,（三）競爭法,此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體 。,用已知特異性 抗體包被 固相載體,測定管加待測抗原和 一定量的酶標抗原使二者與 固相抗體競爭結合,對照管只加一定量酶標抗原 與固相抗體直接結合,分別洗滌 除去未結合 的成分,加底物顯色,分別測定兩管的吸光度值， 根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比， 計算標本中待測抗原含量,對照管由于只加酶標抗原，與固相抗體充分結合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結合的結果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結合，使固相上結合的酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應較弱。,特點一：靈敏性 該測定法的靈敏度來自作為報告集團的酶。眾所周知, 酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導大量的催化反應 ，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。 例如，在測定血清中某一物質的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感度約為510g/ml 。,特點二：特異性 其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結合實質上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。,例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），雖來源于同一病毒，但僅與其相應的抗體結合，而不與另外兩種抗體反應?？乖贵w反應的這種特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質化合物（例如血清）中測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。,ELISA應用實例,飼料中鹽酸克倫特羅的測定 飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素， 簡曲霉毒素 ） 飼料中有害微生物的快速篩檢 （如沙門氏菌 ）,甲胺磷殘留分析 甲基對硫磷殘留分析 呋喃丹殘留分析,ELISA在飼料安全檢測中的應用,ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測,河豚毒素,植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素,苯并芘,主要有除草劑與殺蟲劑兩大類 例如殺暝松（ FN ）、 甲氟磷酸異已酶（ SOMAN ）、 草不綠（ Alachor ）、 西維因（ Carbaryl ）、 多菌靈及克菌丹（ Captan ）等。,農(nóng)藥的檢測：,ELISA檢測 “非典型肺炎”冠狀病毒,ELISA在結締組織病早期診斷中的應用檢測抗異質性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類風濕性關節(jié)炎（PtA）33抗體,ELISA在疾病診斷中的作用,ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體,ELISA試劑盒商業(yè)資訊,ELISA試劑盒,酶聯(lián)免疫井,DNM-9602G酶標分析儀,DNM-9602 標配酶標分析儀,DNM-9602A酶