seldi技術(shù)分析體外培養(yǎng)不同肝細胞株差異蛋白的表達(1)

SELDISELDI 技術(shù)分析體外培養(yǎng)不同肝細胞株技術(shù)分析體外培養(yǎng)不同肝細胞株 差異蛋白的表達差異蛋白的表達(1)(1) 作者：丁守怡，錢冬萌，牟文鳳，閆志勇，宋旭霞， 王斌 【關(guān)鍵詞】表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質(zhì)譜； 蛋白質(zhì)陳列分析；肝腫瘤；腫瘤細胞,培養(yǎng)的；差異蛋白 Analysisofdifferentproteinexpressionsindifferentliv ercellstrainsinvitrousingSELDI 【Abstract】AIM:Toexaminethedifferentialexpressions ofproteinsinhepatomacellline,hepatomacelllinetransf ectedbyHBV（） comparedwithnormallivercelllinebyusingsurfaceenhanc edlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectro metry,soastoestablishafoundationforfurtherstudyingo nthemechanismofhepatomaattheproteinlevel.METHODS:Th e3typesofcellsabovementionedwereculturedasgeneralan dcollectedwhentheywereingoodconditions.Aftercelldis ruption,SELDITOFMSwasemployedtodetectthedifferentia lexpressionsofproteomesofHepG2,HepGandLO2.RESULTS:N inetyoneproteinswerecapturedbyWCX2array.Comparedwit hnormallivercelllines,inthesegmentsfromMr5000to1500 0,proteinsintheHepG2andshowedapparentchanges,inwhic h2proteinsexpressionswereincreasedincarcinomacells, theother5decreased.NineproteinsinHepG2wereincreased and10proteinsinHepGwereincreased.CONCLUSION:TheSELD IProteinChiptechnologycanbeadesiredmethodindetectin gthebiologicalmarkersintheearlierperiodofhepatoma.T hismethodisofconvenience,highsensitivity,andgoodrep roducibility.Thebiologicaltagsoftissuespecificprote inswefoundhaveapotentialapplyingvalueintheearlydiag nosisofhepatoma.Thesetagsarealsomeaningfulinscreeni ngandidentifyingsignalproteinsfromserumandtissuespe cimenindifferenttypesofhepatoma.Certainfoundationha sbeenestablishedinstudyingtheetiopathogenesisofhepa tomaatthelevelofproteins,aswellasthesearchingofnewt herapeutictargetsites. 【Keywords】SELDITOFMS;proteinarrayanalysis;liverne oplasms;tumorcells,cultured;distinctprotein 【摘要】目的：運用表面增強激光解吸/離子化/飛行 時間質(zhì)譜技術(shù),檢測體外培養(yǎng)的肝癌細胞株（HepG2）,轉(zhuǎn)染 乙肝病毒的肝癌細胞株（）與正常肝細胞株（LO2）蛋白質(zhì) 的差異表達，篩選肝細胞癌的標志蛋白，為進一步研究肝 癌發(fā)病的蛋白質(zhì)組學機制奠定基礎(chǔ).方法：常規(guī)培養(yǎng)上述 3 種細胞，細胞狀態(tài)良好時收集細胞，裂解細胞后采用 SELDITOFMS 技術(shù)用 WCX2 芯片檢測 HepG2,LO2 細胞內(nèi)蛋白 質(zhì)組學的差異表達.結(jié)果：WCX2 芯片共捕獲 91 個蛋白，在 Mr500015000 區(qū)段，與正常肝細胞株比較，有 7 個蛋白質(zhì) 在兩種肝癌細胞中出現(xiàn)明顯變化，其中 2 個蛋白在肝癌細 胞中表達量增高，5 個蛋白在肝癌細胞中表達量降低；另外 兩種肝癌細胞株也有其各自的標志蛋白，9 個蛋白分子在 HepG2 表達量增高，10 個蛋白分子在表達量增高.結(jié)論： SELDI 蛋白芯片技術(shù)檢測可作為檢測肝癌早期生物標記的方 法，它簡便，敏感性高，重復性好，本文發(fā)現(xiàn)的這些組織 特異性蛋白生物標記對肝癌的早期診斷有潛在的應用價值， 對我們從血清或組織標本中篩選和鑒定不同型別肝癌細胞 之間的標志蛋白有重要意義，從而為從蛋白質(zhì)水平研究肝 癌的發(fā)病機制及新的治療靶位的尋找奠定了一定的基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質(zhì)譜； 蛋白質(zhì)陳列分析；肝腫瘤；腫瘤細胞，培養(yǎng)的；差異蛋白 0 引言 原發(fā)性肝癌在我國是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率 在部分城市中占惡性腫瘤死因的第二位.每年有 11 萬人死 于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的 45%.肝癌早期沒有明顯 體征，多數(shù)病人確診時已屬晚期，難以治愈，死亡率很高. 所以，對于肝癌的早期診斷，在無癥狀的人群中發(fā)現(xiàn)早期 病例，對控制肝癌的病死率有現(xiàn)實的意義.因此，研究并尋 找有價值的預警肝癌的標志物，成為進一步提高肝癌臨床 治療水平的關(guān)鍵.任何疾病在出現(xiàn)病理變化之前，細胞內(nèi)的 蛋白質(zhì)在成分和數(shù)量上都會有相應的改變，癌癥的發(fā)生是 一個多基因多階段多因子的動力學過程，HCC 也不例外，目 前對肝癌發(fā)生機制的研究大都是在基因水平，但是 mRNA 的 水平并不能真正代表所表達的蛋白質(zhì)水平，因此，要求對 生物功能的執(zhí)行者蛋白質(zhì)進行研究. 蛋白質(zhì)組是指一個基因組、一個細胞或組織或一種生 物體所表達的全部蛋白質(zhì)1.蛋白質(zhì)組學 （Proteomics）是蛋白質(zhì)組概念的延伸，是在整體水平上 研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律的學科.蛋白質(zhì)組學技 術(shù)為研究腫瘤標志物與腫瘤進展轉(zhuǎn)移研究提供良好的技術(shù) 平臺,為研究開辟了新的手段和視角.SELDI 蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 是近年來新興的一種蛋白質(zhì)組學技術(shù)，它具有簡單、快捷、 靈敏等特點，可以檢測分子量在 Mr500500000 之間的蛋白 或多肽，而且所需樣本體積?。?00L） 2-3.我們應 用細胞裂解液裂解體外培養(yǎng)的 3 種細胞（LO2,HepG2,） ，進 行了表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質(zhì)譜技術(shù) （SELDITOFMS）分析，初步建立了正常肝細胞、肝癌細胞 與轉(zhuǎn)染乙肝病毒的肝癌細胞的蛋白表達圖譜4 ，發(fā)現(xiàn)了 一系列（信噪比）差異表達的蛋白，為今后從血清或肝癌 組織中篩選標志蛋白提供科學依據(jù). 1 材料與方法 材料正常肝細胞株（LO2）購自中科院上海細胞庫；肝 癌細胞株（HepG2）及攜帶乙肝病毒的肝癌細胞株（）由第 四軍醫(yī)大學吳力克主任醫(yī)師贈送.HPLC 水，乙晴，三氟乙酸， 白芥子酸（SPA）,TritonX100，尿素，4 羥乙基哌嗪乙磺酸 （HEPES） ，表面活性劑（CHAPS）均購自美國 Sigma 公司， 蛋白質(zhì)芯片時間質(zhì)譜分析儀（PBSC）及 WCX2（弱陽離子 交換芯片）購自美國 CiphergenBiosystems 公司. 方法 細胞總蛋白質(zhì)的提取 LO2,HepG2 細胞采用含 100mL/L 胎牛血清的 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞另外加入終濃度 200g/L 的 G418,細胞長成單層后，用無菌細胞刮刀刮取細胞，PBS 洗 3 次，加入裂解液 （8mol/Lurea,40g/LCHAPS,40mmol/LTrisHCl，pH） 200L,4劇烈震蕩 30min,20817